תכונות ויישומים של מיקרוסקופיה לייזר קונפוקלית
מיקרוסקופ קונפוקאלי סריקת לייזר (LSCM) הוא סוג של מיקרוסקופ שתוכנן על בסיס טכנולוגיית פוקוס מצומד, כלומר, להפוך את מקור אור הלייזר, הדגימה הנבדקת והגלאי, כולם במצב מצומד אחד של השני.
בסיסי
במיקרוסקופים כלליים, מישור המוקד של עדשת האובייקטיבי חופף לגלאי כך שמישור התמונה הנצפה מבודד מהמישור הצירי הסמוך, בעוד שבמיקרוסקופים קונפוקאליים, הדגימה מוארת באמצעות כתם אור מוגבל בעקיפה, וב אפקט בידוד זה מושג על ידי שימוש בחריר בנתיב האור האיסוף בנקודת המוקד של מצומד הנקודה כדי לסנן אור תועה כדי לשפר את הרזולוציה.
תכונות הדמיה
רק האור המוחזר בחזרה משכבת המדגם המצומדת יכול לעבור דרך החור הקטן בנתיב האור האיסוף, והשתקפויות של שכבת המדגם הלא רלוונטיות הנותרות נחסמות על ידי החור הקטן. זה יכול לגרום לעלייה משמעותית ברזולוציה. להלן השוואה זו לצד זו של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב מימדית ומיקרוסקופיה קונפוקלית של אותה דגימה עבה. כאשר מצלמים סדרה של תמונות במישורי מוקד שונים, ניתן להפיק מה שנקרא בדרך כלל "מחסנית z", ותמונה זו מציגה הן את הרזולוציה והן את רווחי הניגודיות שמציעה מיקרוסקופיה קונפוקלית ואת הגורמים הבסיסיים לרווחים אלה. בחינת התמונה בחלק העליון של הערימה עם מישור ההדמיה מעל הרקמה מגלה הרבה אור מפוזר בתמונת הקרינה, בעוד שהתמונה הקונפוקלית נראית שחורה. הפחתה זו ב-PSF בכיוון הצירי אחראית ישירות להבדל ברזולוציה הנצפה בממשק האופטי באמצע ערימת ה-z.
תכונה נוספת של מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר היא שמדובר בטכנולוגיית הדמיה סורקת. הטכנולוגיה המסורתית של תאורה רחבת שדה מאירה את הדגימה כולה, כך שניתן ללכוד את התמונה ישירות בעין בלתי מזוינת או בגלאי, אך LSCM משתמש בקרן או בקרנות מרובות ממוקדות עוברות דרך המדגם לצורך סריקה והדמיה, והתמונה המתקבלת היא נקרא קטע אופטי. להלן מראה את ההבדל בין שיטת ההארה המסורתית בשדה רחב לבין שיטת ההארה הקונפוקלית בסריקת לייזר.
לכן, שיטת עבודה מעשית של מיקרוסקופ קונפוקאלי מודרני מוצגת באיור שלהלן. אור העירור הנפלט מהלייזר עובר דרך מראה דיכרואית וסרק בכיווני x ו-y של הדגימה דרך זוג מראות רוטטות. העירור (או ההשתקפות) של הדגימה האור נכנס לגלאי ה-PMT דרך חריר החריר ונרשם, ותמונת הסריקה המוקלטת משוחזרת על ידי המחשב כדי לקבל את תמונת הדגימה בפועל.
