למה אתה צריך להשתמש במיקרוסקופ קונפוקאלי?
1. מיקרוסקופים אופטיים הגיעו למצב של שלמות באמצעות המאמצים והשיפורים של קודמינו הגדולים. למעשה, מיקרוסקופים רגילים יכולים לספק לנו תמונות מיקרוסקופיות יפות בפשטות ובמהירות. עם זאת, התרחש אירוע שהביא חדשנות מהפכנית לעולם הכמעט מושלם זה של מיקרוסקופיה. זו הייתה המצאת "המיקרוסקופ הקונפוקאלי הסורק בלייזר". המאפיין של סוג חדש זה של מיקרוסקופ הוא שהוא משתמש במערכת אופטית השואבת מידע תמונה רק על פני השטח שבו הפוקוס ממוקד, ומשחזרת את המידע המתקבל בזיכרון התמונה תוך כדי שינוי הפוקוס, ובכך משיגה מידע תלת מימדי מלא. תמונה חיה של אינטליגנציה. באמצעות שיטה זו ניתן להשיג בקלות מידע על צורת פני השטח שלא ניתן לאשר במיקרוסקופ רגיל. בנוסף, עבור מיקרוסקופים אופטיים רגילים, "הגברת הרזולוציה" ו"העמקת עומק המיקוד" הם תנאים סותרים, במיוחד בהגדלות גבוהות. עם זאת, במיקרוסקופיה קונפוקלית, בעיה זו נפתרת בקלות.
2. יתרונות של מערכת אופטית קונפוקלית
המערכת האופטית הקונפוקלית מבצעת הארה נקודתית על המדגם, והאור המוחזר משתמש גם בקולטן נקודתי כדי לקבל את האור. כאשר הדגימה ממוקמת במיקום הפוקוס, כמעט כל האור המוחזר יכול להגיע לפוטו-רצפטור. כאשר המדגם אינו ממוקד, האור המוחזר אינו יכול להגיע אל הפוטורצפטור. במילים אחרות, במערכת האופטית הקונפוקלית, רק התמונה החופפת לפוקוס תופק, וכתמי האור והאור המפוזר חסר התועלת יהיו מוגנים.
3. למה להשתמש בלייזר?
במערכת האופטית הקונפוקלית, המדגם מואר בנקודה, והאור המוחזר נקלט גם באמצעות קולטן נקודתי. לכן, מקורות אור נקודתיים הופכים נחוצים. לייזרים הם מקורות אור נקודתיים מאוד. ברוב המקרים, מקור האור של מיקרוסקופים קונפוקאליים משתמש במקורות אור לייזר. בנוסף, המאפיינים של לייזר כמו מונוכרומטיות, כיווניות וצורת קרן מצוינת הם גם סיבות חשובות לאימוצו הנרחב.
4. מתאפשרת תצפית בזמן אמת המבוססת על סריקה במהירות גבוהה
עבור סריקת לייזר, נעשה שימוש במסיט אופטי אקוסטי (אלמנט AO) בכיוון האופקי ובמראת סריקת אלומה מבוקרת חשמלית (Servo Galvano-mirror) משמשת בכיוון האנכי. מכיוון שליחידת ההסטה האקוסטית-אופטית אין חלק רטט מכני, היא יכולה לסרוק במהירות גבוהה, מה שמאפשר תצפית בזמן אמת על מסך הניטור. המהירות הגבוהה של סוג זה של הדמיה היא פריט חשוב מאוד המשפיע ישירות על מהירות המיקוד ושליפת המיקום.
5. הקשר בין מיקום הפוקוס והבהירות
במערכת האופטית הקונפוקלית, הבהירות היא מקסימלית כאשר הדגימה ממוקמת נכון במיקום הפוקוס, והבהירות שלה תקטן בחדות מלפנים ומאחוריה (קו מוצק באיור 4). הסלקטיביות הרגישה הזו של מישור המוקד היא גם העיקרון מאחורי קביעת כיוון הגובה והרחבת עומק המיקוד של המיקרוסקופ הקונפוקאלי. לעומת זאת, למיקרוסקופ אופטי רגיל אין שינויי בהירות ברורים לפני ואחרי מיקום המיקוד (קו מקווקו באיור 4).
6. ניגודיות גבוהה ורזולוציה גבוהה
במיקרוסקופים אופטיים רגילים, האור המוחזר מהחלק הלא-מיקוד יפריע וייחפף לחלק הדמיית הפוקוס, וכתוצאה מכך הפחתה בקונטרסט התמונה. לעומת זאת, במערכת האופטית הקונפוקלית, אור תועה מחוץ לפוקוס ואור תועה בתוך עדשת האובייקט מוסרים כמעט לחלוטין, כך שניתן לקבל תמונה בעלת ניגודיות גבוהה מאוד. בנוסף, בגלל שהאור עובר דרך עדשת האובייקטיב פעמיים, התמונה הנקודתית מתחדדת, מה שמשפר גם את כוח הרזולוציה של המיקרוסקופ.
