מה המטרה של מיקרוסקופ קונפוקאלי?
1. לאחר המאמצים והשיפורים של קודמינו הגדולים, המיקרוסקופ האופטי הגיע לנקודת השלמות. למעשה, מיקרוסקופים רגילים יכולים לספק לנו תמונות מיקרוסקופיות יפות בפשטות ובמהירות. עם זאת, קרה אירוע שהביא חדשנות מהפכנית לעולם המיקרוסקופ הכמעט מושלם הזה, שהוא המצאת "המיקרוסקופ הקונפוקאלי הסורק בלייזר". התכונה של סוג חדש זה של מיקרוסקופ היא שהוא מאמץ מערכת אופטית המחלצת רק מידע תמונה על פני השטח שבו הפוקוס מרוכז, ומשחזרת את המידע המתקבל בזיכרון התמונה תוך שינוי הפוקוס, כך שניתן יהיה לקבל מידע תלת מימדי מלא. שהושג. דימוי מובהק של אינטליגנציה. בשיטה זו ניתן לקבל בקלות מידע על צורת פני השטח שלא ניתן לאשר באמצעות מיקרוסקופ רגיל. בנוסף, עבור מיקרוסקופים אופטיים רגילים, "הגדלת רזולוציה" ו"העמקת עומק המיקוד" הם תנאים סותרים, במיוחד בהגדלות גבוהות, הסתירה הזו בולטת יותר, אך מבחינת מיקרוסקופים קונפוקאליים, בעיה זו נפתרת בקלות.
2. יתרונות מערכת אופטית קונפוקלית
תרשים סכמטי של מיקרוסקופ קונפוקאלי לייזר
המערכת האופטית הקונפוקלית מבצעת הארה נקודתית על המדגם, והאור המוחזר נקלט גם על ידי הקולטן הנקודתי. כאשר הדגימה ממוקמת בעמדת הפוקוס, כמעט כל האור המוחזר יכול להגיע לפוטו-רצפטור, וכאשר הדגימה לא ממוקדת, האור המוחזר לא יכול להגיע לפוטו-רצפטור. כלומר, במערכת האופטית הקונפוקלית תופק רק התמונה החופפת לנקודת המוקד, וכתמי האור והאור המפוזר חסר התועלת יהיו מסוככים.
3. למה להשתמש בלייזר?
במערכת האופטית הקונפוקלית, המדגם מואר בנקודה, והאור המוחזר נקלט גם על ידי קולטן נקודתי. לכן, מקור אור נקודתי הופך להיות הכרחי. לייזרים הם מקורות אור נקודתיים מאוד. ברוב המקרים, מקורות אור לייזר משמשים כמקורות אור עבור מיקרוסקופים קונפוקאליים. בנוסף, המאפיינים של מונוכרומטיות, כיווניות וצורת קרן מצוינת של לייזר הם גם סיבות חשובות לאימוץ הרחב.
4. מתאפשרת תצפית בזמן אמת המבוססת על סריקה במהירות גבוהה
עבור סריקת לייזר, יחידת ההטיה האופטית המופעלת אקוסטית (Acoustic Optical Deflector, AO element) משמשת בכיוון האופקי, ו- Servo Galvano-mirror משמשת בכיוון האנכי. מכיוון שליחידת ההטיה האקוסטו-אופטית אין חלק רטט מכני, היא יכולה לבצע סריקה במהירות גבוהה ותצפית בזמן אמת על מסך הצג אפשרית. ההדמיה המהירה הזו היא פריט חשוב מאוד המשפיע ישירות על מהירות המיקוד ושליפת המיקום.
5. הקשר בין מיקום הפוקוס והבהירות
במערכת האופטית הקונפוקלית, בהירות הדגימה היא המקסימלית כאשר הדגימה ממוקמת נכון במיקום המוקד, והבהירות שלה תקטן בחדות לפניה ואחריה (הקו המוצק באיור 4). הסלקטיביות הרגישה של מישור המוקד היא גם העיקרון של קביעת כיוון גובה המיקרוסקופ הקונפוקאלי והרחבת עומק המוקד. לעומת זאת, למיקרוסקופים אופטיים רגילים אין שינויי בהירות משמעותיים לפני ואחרי מיקום המיקוד.
6. ניגודיות גבוהה, רזולוציה גבוהה
במיקרוסקופים אופטיים רגילים, עקב הפרעה של האור המוחזר מחלק הפוקוס, הוא חופף לחלק הדמיית הפוקוס, וכתוצאה מכך ירידה בקונטרסט התמונה. מאידך, במערכת האופטית הקונפוקלית, האור המפוזר מחוץ לנקודת המוקד והאור המפוזר בתוך עדשת האובייקט מוסרים כמעט לחלוטין, כך שניתן לקבל תמונה בעלת ניגודיות גבוהה מאוד. בנוסף, מכיוון שהאור עובר דרך עדשת האובייקטיב פעמיים, התמונה הנקודתית מתחדדת תחילה, מה שגם משפר את כוח הרזולוציה של המיקרוסקופ.
7. פונקציית לוקליזציה אופטית
במערכת האופטית הקונפוקלית, האור המוחזר מלבד הנקודה החופפת לנקודת המוקד מוגן על ידי המיקרו-נקבים. לכן, כאשר מתבוננים בדגימה תלת מימדית, נוצרת תמונה כאילו הדגימה פרוסה עם מישור המוקד (איור 5). אפקט זה ידוע בשם לוקליזציה אופטית והוא אחד מההתמחויות של מערכות אופטיות קונפוקאליות.
8. מיקוד פונקציית זיכרון נייד
מה שנקרא האור המוחזר מחוץ לנקודת המוקד מוגן על ידי המיקרו-נקבים. מצד שני, ניתן לשקול שכל הנקודות בתמונה שנוצרות על ידי המערכת האופטית הקונפוקלית חופפות לנקודת המוקד. לכן, אם הדגימה התלת מימדית מועברת לאורך ציר ה-Z (ציר אופטי), התמונות מצטברות ומאוחסנות בזיכרון, ולבסוף תתקבל התמונה שנוצרת על ידי כל הדגימה ונקודת המוקד. הפונקציה של העמקה אינסופית של עומק המיקוד בדרך זו נקראת הפונקציה של זיכרון נייד.
9. פונקציית מדידת צורת פני השטח
במונחים של פונקציית העברת הפוקוס, ניתן למדוד את צורת פני השטח של המדגם באופן ללא מגע על ידי הוספת מעגל הקלטה של גובה פני השטח. בהתבסס על פונקציה זו, ניתן לרשום את הקואורדינטות של ציר ה-Z הנוצרות על ידי ערך הבהירות המקסימלי בכל פיקסל, ועל סמך מידע זה ניתן לקבל מידע הקשור לצורת משטח המדגם.
10. פונקציית מדידת מיקרו-גודל דיוק גבוהה
יחידת קליטת האור מאמצת חיישן הדמיה CCD 1-ממדי, כך שהוא אינו מושפע מהטיית הסריקה של מכשיר הסריקה, כך שניתן להשלים מדידה דיוק גבוהה. בנוסף, עקב השימוש בפונקציית זיכרון הסטת הפוקוס עם עומק מיקוד (העמקה) ניתן להתאמה, ניתן לבטל את שגיאת המדידה הנגרמת מהעברת הפוקוס.
11. ניתוח תמונה תלת מימדית
באמצעות פונקציית מדידת צורת פני השטח, תוכל ליצור בקלות תמונה תלת מימדית של משטח המדגם. לא רק זה, אלא גם יכול לבצע מגוון ניתוחים כגון: מדידת חספוס פני השטח, שטח, נפח, שטח פנים, מעגליות, רדיוס, אורך מקסימלי, היקף, מרכז כובד, תמונה טומוגרפית, טרנספורמציה FFT, מדידת רוחב קו וכו' .
מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי לייזר יכול לשמש לא רק לצפייה במורפולוגיה של התא, אלא גם לניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים תוך-תאיים, סטטיסטיקות צפיפות אופטית ומדידה של מורפולוגיה של התא.
