למיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-פוטונים יש יתרונות רבים:
1) אורכי גל ארוכים יותר של אור מושפעים פחות מפיזור מאשר אורכי גל קצרים יותר של אור לחדור לדגימה;
(2) מולקולות פלואורסצנטיות מחוץ למישור המוקד אינן נרגשות כך שיותר אור עירור יכול להגיע למישור המוקד, כך שאור העירור יוכל לחדור עמוק יותר לתוך הדגימה;
3) אורכי גל ארוכים יותר של אור קרוב לאינפרא אדום רעילים פחות לתאים מאשר אורכי גל קצרים יותר;
4) כאשר משתמשים במיקרוסקופ דו-פוטונים כדי לצפות בדגימה, הלבנת צילום ופוטוטוקסיות קיימים רק במישור המוקד. לכן, מיקרוסקופים דו-פוטונים מתאימים יותר ממיקרוסקופים חד-פוטונים לתצפית על דגימות עבות, לתצפית על תאים חיים או לביצוע ניסויים בהלבנה נקודתית.
ידע במיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי
העיקרון הבסיסי של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי: מקור אור נקודתי משמש להקרנת הדגימה, ויוצר נקודת אור קטנה ומוגדרת היטב במישור המוקד. הקרינה הנפלטת מנקודה זו לאחר ההקרנה נאספת על ידי עדשת האובייקטיבית ונשלחת חזרה אל מפצל הקרניים המורכב ממראה כרומטית דו-כיוונית לאורך נתיב האור המקורי של הקרנה. מפצל הקרניים שולח את הקרינה ישירות לגלאי. גם למקור האור וגם לגלאי יש לפניהם חור חריר, הנקרא חריר תאורה וחור הזיהוי, בהתאמה. לשניהם אותה גיאומטריה, בערך 100-200 ננומטר, והם מצומדים ביחס לנקודת האור במישור המוקד, כלומר, נקודת האור עוברת דרך סדרה של עדשות ובסופו של דבר יכולה להיות ממוקדת בשתי הנקודות המאירות. וחרירי גלאי. בדרך זו, אור ממישור המוקד יכול להתכנס בתוך פתח הבדיקה, בעוד שאור מפוזר מלמעלה או מתחת למישור המוקד חסום מחוץ לפתח הבדיקה ולא ניתן לצלם. הלייזר סורק את הדגימה נקודה אחר נקודה, וצינור הפוטו-מכפיל לאחר זיהוי החור מקבל גם את התמונה הקונפוקלית של נקודת האור המקבילה נקודה אחר נקודה, המומרת לאות דיגיטלי ומשודרת למחשב, ולבסוף מתכנסת לכדי ברור. תמונה קונפוקלית של כל מישור המוקד על המסך.
כל תמונת מישור מוקד היא למעשה חתך אופטי של הדגימה, ולחתך האופטי הזה תמיד יש עובי מסוים, המכונה גם יריעה אופטית. מכיוון שעוצמת האור בנקודת המוקד גדולה בהרבה מזו שבנקודה הלא-מוקדית, ואור המישור הלא-מוקד מסונן על ידי חור הסיכה, עומק השדה של המערכת הקונפוקאלית מוערך לאפס, והסריקה לאורך כיוון ציר ה-Z מאפשרת לטומוגרפיה אופטית ליצור פרוסה אופטית דו מימדית של הדגימה הנצפה בנקודת המוקד. שילוב של סריקת מישור XY (מישור מוקד) עם סריקה בציר Z (ציר אופטי), ניתן לקבל תמונה תלת מימדית של הדגימה על ידי צבירת שכבות עוקבות של תמונות דו מימדיות, אשר מעובדות על ידי תוכנת מחשב מיוחדת.
משמעות הדבר היא שחור הזיהוי וחור החריר של מקור האור ממוקדים תמיד באותה נקודה, כך שקרינה הנרגשת מחוץ למישור המוקד אינה יכולה להיכנס לחור הזיהוי.
עקרון העבודה של לייזר confocal בא לידי ביטוי פשוט בכך שהוא משתמש בלייזר כמקור אור, על בסיס הדמיה מסורתית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי, מכשיר נוסף לסריקת לייזר ומכשיר מיקוד מצומד, באמצעות בקרת מחשב לביצוע מערכת רכישת ועיבוד תמונה דיגיטלית.
