שיטת התצפית העיקרית של מיקרוסקופ אופטי היא תצפית פלואורסצנציה
פלואורסצנטי מתייחס לתהליך שבו חומר ניאון פולט אור עם אורך גל ארוך יותר כמעט בו זמנית כאשר הוא מוקרן באור באורך גל מסוים (איור 1). כאשר אור באורך גל מסוים (אורך גל עירור) פוגע במולקולה, כמו אלו הנמצאות בפלוורופור, אנרגיית הפוטון נספגת באלקטרונים של המולקולה. לאחר מכן, האלקטרונים עוברים ממצב הקרקע (S0) לרמת אנרגיה גבוהה יותר, המצב הנרגש (S1'). תהליך זה נקרא עירור①. האלקטרון נשאר במצב הנרגש למשך 10-9–10-8 שניות, שבמהלכן האלקטרון מאבד מעט אנרגיה②. במהלך תהליך עזיבת האלקטרונים את המצב הנרגש (S1) וחוזרים למצב הקרקע③, משתחררת האנרגיה הנותרת הנספגת במהלך תהליך העירור.
זמן השהייה של מולקולת הפלורסנט במצב הנרגש הוא משך חיי הקרינה, שהוא בדרך כלל ברמה של ננו-שניות, והוא מאפיין אינהרנטי של מולקולת הפלורסנט עצמה. הדמיית חיים פלואורסצנטית (FLIM), המשתמשת בטכנולוגיית הדמיית חיים פלואורסצנטית, נקראת הדמיית חיים פלואורסצנטית (FLIM). בנוסף להדמיית עוצמת הקרינה, ניתן לקבל מדידות פונקציונליות ומדויקות יותר לעומק כדי להשיג קונפורמציה מולקולרית, אינטראקציות בין-מולקולריות ומיקרו-סביבה של מולקולות. מידע שקשה להשיג בהדמיה אופטית קונבנציונלית.
תכונה חשובה נוספת של הקרינה היא הסטוק סטוקס, ההבדל באורך הגל בין שיאי העירור והפליטה (איור 2). בדרך כלל אורך הגל הפליטה ארוך מאורך גל העירור. הסיבה לכך היא שהאלקטרונים יאבדו חלק מהאנרגיה שלהם בתהליך הרפיה לאחר התרגשות החומר הפלורסנטי ולפני שחרור פוטונים. קל יותר לראות חומרים פלואורסצנטיים עם תזוזות סטוקס גדולות יותר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי וקוביות מסנן פלואורסצנטי
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא מיקרוסקופ אופטי העושה שימוש בתכונות פלואורסצנטיות לצורך תצפית והדמיה, ונמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים כגון ביולוגיה של התא, נוירוביולוגיה, בוטניקה, מיקרוביולוגיה, פתולוגיה וגנטיקה. להדמיית פלואורסצנציה יתרונות של רגישות גבוהה וסגוליות גבוהה, והיא מתאימה מאוד לצפייה בהתפלגות של חלבונים ואברונים ספציפיים ברקמות ובתאים, חקר הקולקליזציה והאינטראקציה, מעקב אחר תהליכים דינמיים בחיים כמו שינויים בריכוז היונים. , וכו.
רוב המולקולות בתאים אינן מקרינות, וכדי לראות אותן יש לסמן אותן בצורה פלואורסצנטית. ישנן שיטות רבות של תיוג ניאון, כגון תיוג ישיר (כגון שימוש ב-DAPI לתיוג DNA), או צביעה חיסונית באמצעות תכונות קושרות האנטיגן של נוגדנים, או שימוש בחלבונים ניאון (כגון GFP, חלבון פלואורסצנטי ירוק) כדי לסמן חלבוני מטרה , וכריכה הפיכה. צבעים סינתטיים (כגון Fura-2) וכן הלאה.
כיום, מיקרוסקופ הקרינה הפך לציוד ההדמיה הסטנדרטי של מעבדות ופלטפורמות הדמיה שונות, והוא עוזר טוב לניסויים היומיומיים שלנו. מיקרוסקופי פלואורסצנטי מחולקים בעיקר לשלוש קטגוריות: מיקרוסקופים פלואורסצנטיים זקופים (מתאימים לחיתוך), מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הפוכים (מתאימים לתאים חיים, תוך התחשבות בחיתוך), סטריאוסקופים פלואורסצנטיים (מתאימים לדגימות גדולות יותר, כגון צמחים, דג זברה (בוגר/עמבריו) ) , מדקה, איברי עכבר/עכברושים וכו').
בלוק מסנן פלואורסצנטי הוא מרכיב הליבה של הדמיית פלואורסצנטי במיקרוסקופ. הוא מורכב משלושה חלקים: מסנן עירור, מסנן פליטה ומפצל אלומה דיכרואי. הוא מותקן בגלגל המסנן. לדוגמה, Leica DMi8 מצויד בגלגל סינון של 6-מיקום (איור 3). מספר המיקומים של גלגלי מיקרוסקופ שונים יהיה שונה, וכמה מיקרוסקופים משתמשים בשקופיות בלוק סינון.
בלוק המסנן ממלא תפקיד חשוב בהדמיית פלואורסצנציה: מסנן העירור בוחר את אור העירור כדי לעורר את הדגימה, וחוסם אור באורכי גל אחרים; האור העובר דרך מסנן העירור עובר דרך המראה הדיכרואית (תפקידו לשקף את אור העירור ולהעביר את הקרינה), לאחר השתקפות, הוא ממוקד על ידי עדשת האובייקט, מקרין את המדגם ומעורר את הקרינה המתאימה, כלומר , נפלט אור. האור הנפלט נאסף על ידי עדשת האובייקטיב, עובר דרך מפצל האלומות הדיכרואי ומגיע למסנן הפליטה. כפי שמוצג באיור 4: אורך גל העירור הוא 450-490nm, המראה הדיכרוית מחזירה אור קצר מ-510nm, מעבירה אור ארוך מ-510nm, וטווח הקליטה של האור הנפלט הוא 520-560nm.
