מאפיינים טכניים וכישורי שימוש של מיקרוסקופ פלואורסצנטי דו-פוטונים
מיקרוסקופיה פלואורסצנטית דו-פוטונים היא טכנולוגיה חדשה המשלבת מיקרוסקופיה קונפוקלית של סריקת לייזר וטכנולוגיית עירור שני-פוטונים.
העיקרון הבסיסי של עירור שני פוטונים הוא: במקרה של צפיפות פוטון גבוהה, מולקולות פלואורסצנטיות יכולות לספוג שני פוטונים באורך גל ארוך בו-זמנית, ולפלוט פוטון באורך גל קצר יותר לאחר תקופה קצרה של מה שנקרא חיי מצב מעורר. . ; האפקט זהה לשימוש בפוטון עם אורך גל חצי מאורך הגל הארוך כדי לעורר מולקולה ניאון. עירור שני פוטונים דורש צפיפות פוטון גבוהה. על מנת לא לגרום נזק לתאים, מיקרוסקופיה דו-פוטונים משתמשת בלייזרים פולסים בעלי אנרגיה גבוהה. ללייזר שפולט לייזר זה יש אנרגיית שיא גבוהה ואנרגיה ממוצעת נמוכה, רוחב הפולסים שלו הוא רק 100 פמט-שניות, ותקופתו יכולה להגיע ל-80 עד 100 מגה-הרץ. כאשר משתמשים בעדשת אובייקטיבית בעלת צמצם מספרי גבוה למיקוד הפוטונים של הלייזר הדופק, צפיפות הפוטונים בנקודת המוקד של עדשת האובייקטיבית היא הגבוהה ביותר, ועירור שני הפוטונים מתרחש רק בנקודת המוקד של עדשת האובייקט. למיקרוסקופ שני-פוטונים אין צורך בחריר קונפוקאלי, מה שמשפר את יעילות זיהוי הקרינה. זוהי שיטת מחקר חשובה בתחומי מורפולוגיה, ביולוגיה מולקולרית של תאים, מדעי המוח ופרמקולוגיה.
1. הרקע להופעתה של מיקרוסקופיה דו-פוטונים - שתי מגבלות של מיקרוסקופיה קונפוקלית לייזר מסורתית:
1) האחת היא תופעת הפוטוטוקסיות: מכיוון שהחור הקונפוקאלי חייב להיות קטן מספיק כדי לקבל תמונה ברזולוציה גבוהה, והצמצם הקטן יחסום חלק גדול מהקרינה הנפלטת מהדגימה, כולל הקרינה הנפלטת ממישור המוקד, כן, אור העירור חייב להיות חזק מספיק כדי להשיג יחס אות לרעש מספיק; והלייזר בעוצמה גבוהה יגרום לצבע הניאון לדהות במהירות במהלך סריקה מתמשכת, והאות הניאון יחלש יותר ויותר ככל שהסריקה תתקדם.
2) רעילות פוטו היא בעיה נוספת. תחת קרינת לייזר, מולקולות צבע ניאון רבות ייצרו ציטוטוקסינים כגון חמצן בודד או רדיקלים חופשיים, ולכן יש להגביל את זמן הסריקה וצפיפות ההספק האופטית של אור העירור בניסוי כדי לשמור על צפיפות הדגימה. פָּעִיל. במחקר על דגימות פעילות, במיוחד שלבי הצמיחה וההתפתחות השונים של דגימות פעילות, ההלבנה הפוטו-טוקסית הופכת את המחקרים הללו למצומצמים מאוד.
2. למה אתה אומר שמיקרוסקופים דו-פוטונים בדרך כלל לא צריכים להיות מצוידים בלייזרי עירור אולטרה סגול?
מיקרוסקופיה דו-פוטונים היא טכנולוגיית עירור פלואורסצנטית המבוססת על אפקט עירור שני-פוטונים: ניתן לעורר מולקולות צבע ניאון על ידי קליטת שני פוטונים בעלי אנרגיה נמוכה בו-זמנית (מרווח הזמן בין שני פוטונים להגיע למולקולות ניאון הוא פחות משנייה פמטשנייה אחת ), אפקט העירור שלו יכול להיות שווה ערך לקליטת פוטון בעל אנרגיה גבוהה של 1/2 אורך גל. לדוגמה, קליטת שני פוטונים באורכי גל אדומים שווה ערך למולקולה הסופגת אולטרה סגול. פוטונים באורך גל ארוך אינם נספגים בקלות על ידי תאים, כך שהפוטו-רעילות לתאים חיים מופחתת, וגם ההלבנה הפוטו-לאקינג מופחתת. בדרך זו, זה לא רק ממלא את הפונקציה של עירור אולטרה סגול, אלא גם מונע את הנזק של אור אולטרה סגול לדגימה.
3. מה מיוחד בלייזר של מיקרוסקופ דו-פוטונים?
ההסתברות לקליטת שני פוטונים תלויה עד כמה שני הפוטונים המתרחשים חופפים במרחב ובזמן (שני הפוטונים חייבים להגיע תוך 10-18 שניות). חתך קליטת שני הפוטונים קטן, ורק פלואורפורים באזורים עם שטף פוטון גדול מתרגשים. לכן, רוב הלייזרים המשמשים הם לייזרים טיטניום ספיר, שיכולים להשיג מהירויות סריקה של פיקו-שניות או פמט-שניות, ובעלי הספק שיא גבוה מאוד והספק ממוצע נמוך, כך שניתן להפחית או לבטל את ההלבנה והפוטו-רעילות. הדבר החשוב ביותר הוא לספק צפיפות גבוהה מאוד של פוטונים בטווח קטן, שיכול להבטיח עירור בו-זמנית של שני פוטונים.
4. מהם היתרונות של עירור שני פוטונים?
1) הגדל את הסלקטיביות של הצבע: טווח אור העירור של הלייזר של המערכת הקונפוקלית (Ar, Ar/Kr, HeNe) הוא 488nm - 647nm. משמעות הדבר היא ניסוי עם צבעי פלורסנט מעוררי UV, למשל עם DAPI, Hoescht. אורך גל העירור של שני פוטון הוא פי שניים מזה של פוטון בודד, כך שצבעים המעורבים על ידי אולטרה סגול יכולים להיות מעוררים על ידי אור קרוב לאינפרא אדום.
2) הפחת את ההלבנה בפוטו: בגלל הפחתת ההלבנה בפוטו, שיעור ההצלחה של ניסויים באמצעות CFP/YFP להעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) עולה.
3) אין צורך בעדשת אובייקטיבית מיוחדת: מנקודת מבט החומרה, עירור של צבעים מעוררי UV עם אורך הגל של אור קרוב לאינפרא אדום אינו דורש רכיבים אופטיים UV מיוחדים.
4) שפר את יחס האות לרעש: אורך גל אור העירור ואורך גל האור הנפלט יש הבדל גדול, מה שמשפר את יחס האות לרעש.
5) הלבנה מקומית לנקודת המוקד: מכיוון שעירור הקרינה מתרחש רק בנקודת המוקד של המטרה, אין צורך בחריר קונפוקאלי. זה משפר את זיהוי האור והלבנת צילום מתרחשת רק בנקודת המוקד.
6) קל יותר לחדור לדגימות: אור באורך גל אינפרא אדום לא מתפזר בקלות על ידי תאים ויכול לחדור לדגימות עמוקות יותר.
5. בהשוואה למיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר, מהו השיפור הגדול ביותר שנעשה במיקרוסקופיה דו-פוטונים?
1) מופחתת הלבנת צילום.
2) פוטו-רעילות מופחתת.
3) לא קל לפזר, וקל יותר לחדור דגימות עבות, כמו פרוסות מוח.
