נוהל סטנדרטי לכיול מקטבים במיקרוסקופ מקטב
מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונה ממיקרוסקופ אופטי רגיל בכך שהוא אינו צופה בדגימות תחת תאורה של מקורות אור רגילים. במקום זאת, הוא משתמש באורך גל מסוים של אור (בדרך כלל אור אולטרה סגול, אור סגול כחול) כדי לעורר את החומרים הפלורסנטים בתוך הדגימה מתחת למיקרוסקופ, מה שגורם להם לפלוט פלואורסצנטיות. לכן, תפקידו של מקור האור במיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו הארה ישירה, אלא כמקור אנרגיה לעורר את החומרים הפלורסנטים בתוך הדגימה. הסיבה שבגללה אנו יכולים לצפות בדגימות אינה נובעת מהארת מקור האור, אלא תופעת הקרינה שמפגינים החומרים הפלורסנטים בתוך הדגימה לאחר קליטת אנרגיית האור הנרגשת. מכאן ניתן לראות כי המאפיין של מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא בעיקר בכך שמקור האור שלה יכול לספק כמות גדולה של אור עירור בטווח אורכי גל מסוים, כך שהחומרים הפלורסנטים בדגימה יכולים לקבל את העוצמה הדרושה של אור עירור. יחד עם זאת, מיקרוסקופי פלואורסצנטי חייבים להיות בעלי מערכות סינון מתאימות. מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא כלי בסיסי בכימיה של רקמות הקרינה. הוא מורכב ממרכיבים עיקריים כגון מקור אור במתח גבוה במיוחד, מערכת סינון (כולל לוחות סינון עירור ודיכוי), מערכת אופטית ומערכת צילום. הוא משתמש באור באורך גל מסוים כדי לרגש את הדגימה ולפלוט פלואורסצנטיות.
1. שיטות עירור פלואורסצנטי: לפי טווח אורכי הגל של האור, ישנם שני סוגים: שיטת עירור UV (באמצעות תאורה אולטרה סגולה) ושיטת עירור BV (שימוש באור סגול כחול). שיטת עירור UV משתמשת באור אולטרה סגול קרוב קצר מ-400 ננומטר לצורך עירור. בשיטה זו אין אור עירור גלוי, ולכן הקרינה הנצפית מציגה את הקרינה המובנית של הצבע, מה שמקל על ההבחנה בין הקרינה הספציפית על הדגימה לבין הקרינה העצמית של רקמת הרקע.
2. שיטת עירור BV: היא כוללת עירור מאור אולטרה סגול לכחול שבמרכזו 404 ננומטר ו-434 ננומטר. שיטה זו משתמשת באור כחול כדי להקרין את הדגימה, ולכן המסנן המנותק- של מערכת תצפית הקרינה חייב להשתמש במסנן שיכול לחסום לחלוטין אור כחול ולעבור במלואו את הקרינה הירוקה והצהובה הנדרשת. פיגמנטים פלורסנטיים המשמשים לשיטת נוגדנים פלואורסצנטיים. אורך גל הקליטה המרבי של אור עירור ואורך גל הפליטה המרבי של הקרינה קרובים יחסית, ולכן המסנן המשמש בשיטת עירור BV חייב להשתמש במסנן חתך חד. בשיטה זו ניתן להשתמש באור כחול כאור עירור, כך שיעילות הספיגה של פיגמנטים פלורסנטים גבוהה, וניתן לקבל תמונות בהירות יותר. החיסרון הוא שלא ניתן לראות פלואורסצנטי מתחת ל-500nm, בעוד שקרינה מעל 500nm גורמת לכל התמונה להיראות צהובה. בשיטת הנוגדנים הפלורסנטיים, הספציפיות נקבעת בעיקר על ידי הצבע הייחודי לפיגמנטים פלואורסצנטיים, כך שכאשר דנים בספציפיות עדינה, לחסרונות שיטת עירור BV שהוזכרו לעיל יש לרוב השפעה משמעותית.
