טכניקות צביעה ותצפית מיקרוסקופית במיקרו-אורגניזמים
1. מטרה
1.1 למד את הטכניקות הבסיסיות של מריחות חיידקים וצביעה.
1.2 לשלוט בשיטת הצביעה הפשוטה של חיידקים.
1.3 להבין מראש את המאפיינים המורפולוגיים של חיידקים, ולגבש את הידע כיצד להשתמש בעדשות שמן ובטכניקות פעולה אספטיות.
2 עקרונות
מריחה וצביעה של חיידקים היא טכניקה בסיסית בניסויים במיקרוביולוגיה. תאי חיידק הם קטנים ושקופים, מה שמקשה על זיהוים במיקרוסקופ אור רגיל; הם חייבים להיות מוכתמים. צבע יחיד משמש לצביעת חיידקים, כך שהחיידקים המוכתמים יוצרים הבדל צבע ברור מהרקע, כך שניתן לראות את המורפולוגיה והמבנה שלהם בצורה ברורה יותר. שיטה זו קלה לתפעול ומתאימה להתבוננות בצורתם הכללית של תאי החיידק וסידור החיידקים. צבעים בסיסיים משמשים בדרך כלל לצביעה פשוטה. הסיבה לכך היא שבתמיסות ניטרליות, אלקליות או חומציות חלשות, תאי חיידקים בדרך כלל טעונים שלילי, וכאשר צבעים בסיסיים מיוננים, החלק הצבוע של המולקולות שלהם טעון חיובי, ולכן הם אלקליים. החלק המכתים של הצבע משתלב בקלות עם חיידקים כדי לצבוע אותם. תאי החיידק המוכתמים מנוגדים בצורה חדה לרקע, מה שמקל על זיהוים במיקרוסקופ. הצבעים הנפוצים לצביעה פשוטה כוללים מתילן כחול, סגול קריסטל, פוקסין בסיסי וכו'. כאשר חיידקים מפרקים סוכרים ומייצרים חומצה, מה שגורם ל-pH של מצע התרבות לרדת, המטען החיובי על החיידקים גדל. בשלב זה, ניתן להשתמש בצבעים חומציים כגון אאוזין, חומצי פוקסין או אדום קונגו לצביעה. יש לתקן חיידקים לפני הצביעה. יש לו שתי מטרות: האחת היא להרוג חיידקים ולגרום להם להיצמד לשקופית הזכוכית; השני הוא להגביר את הזיקה שלהם לצבעים. שתי שיטות נפוצות הן חימום וקיבוע כימי. בעת התיקון, נסה לשמור על הצורה המקורית של התאים.
3 חומרים
3.1 חיידקים: Bacillus subtilis 12-18h תרבות אגר תזונתית, Staphylococcus aureus 24h תרבות אגר תזונתית, Escherichia coli 24h תרבית אגר נטויה, תרבות אגר תזונתית של שמרי אפייה.
3.2 חומר צביעה: צבע מתילן כחול אלקליין של לו (או צבע סגול קריסטל אמוניום אוקסלט), צבע פוקסין חומצה קרבולית.
3.3 מכשירים או כלים אחרים: מיקרוסקופ, מנורת אלכוהול, שקף, לולאת חיסון, מתלה שקופיות, בקבוק דו-שכבתי (המכיל שמן ארז וקסילן), רקמת עדשה, מלוחים פיזיולוגיים או מים מזוקקים וכו'.
4. תהליך: מריחה → ייבוש → קיבוע → צביעה → כביסה → ייבוש → בדיקה מיקרוסקופית.
5 שלבים
5.1 מריחה: קח שתי שקופיות זכוכית נקיות וללא שמן. בתנאים סטריליים, הניחו טיפה קטנה של תמיסת מלח רגילה (או מים מזוקקים) על כל מרכז של שקף הזכוכית. השתמש בלולאת חיסון כדי לעקר את החיידקים מ-Bacillus subtilis. , Micrococcus luteus ו-Escherichia coli, קוטפים מדשאה קטנה של חיידקים בטיפות המים על השיפוע, מערבבים היטב ומרחים אותו לסרט דק. אם אתה משתמש במריחה של תרחיף חיידקים (או תרבית נוזלית), אתה יכול להשתמש בלולאת חיסון כדי לבחור 2 עד 3 לולאות ולהחיל אותן ישירות על השקף. יש להקפיד לא להפיל יותר מדי מי מלח פיזיולוגי (מים מזוקקים) ולהסיר חיידקים ולמרוח אותו בצורה אחידה ולא סמיכה מדי.
5.2 ייבוש יבש באופן טבעי בטמפרטורת החדר. אתה יכול גם לחמם אותו מעט מעל מנורת אלכוהול כשהצד המצופה כלפי מעלה כדי לייבש אותו. אבל הקפידו לא להתקרב מדי ללהבה, שכן טמפרטורה גבוהה מדי תהרוס את המורפולוגיה של החיידקים.
5.3 קיבוע אם נעשה שימוש בייבוש מחומם, קיבוע וייבוש משולבים לשלב אחד, והשיטה זהה לייבוש. למרוח, לייבש ולתקן חום.
5.4 צביעה: הניחו את השקף שטוח על מדף השקופיות, והוסיפו 1 עד 2 טיפות של תמיסת צבע על המריחה (מתאים שתמיסת הצבע רק תכסה את סרט המריחה). צובעים במתילן כחול בסיסי של לו למשך 1 עד 2 דקות, ומכתים בפוקסין חומצה קרבולית (או אמוניום אוקסלט קריסטל סגול) למשך כדקה אחת.
5.5 שטיפה במים: שופכים את תמיסת הצבע ושוטפים בעדינות במי ברז מקצה אחד של השקף עד שהמים שירדו מהמריחה יהיו חסרי צבע. בעת כביסה במים, אל תשטוף את המשטח המצופה ישירות במים. זרימת המים לא צריכה להיות מהירה מדי או גדולה מדי כדי למנוע את נפילת הסרט המריחה.
5.6 ייבוש: מנערים את טיפות המים על השקף ומייבשים באופן טבעי, מייבשים עם מייבש שיער או ספיגים בנייר סופג (יש להיזהר לא לנגב את החיידקים). 5.7 בדיקה מיקרוסקופית לאחר שהממרח יבש, בצעו בדיקה מיקרוסקופית. המריחה חייבת להיות יבשה לחלוטין לפני הצפייה בעדשת שמן.
6 תוצאות צייר את המורפולוגיה של E. coli ו- Micrococcus luteus שנצפו לאחר צביעה בודדת.
