עקרונות של מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר (LSCM)
מיקרוסקופ קונפוקאלי לייזר משתמש בחריר תאורה הממוקם מאחורי מקור האור ובחור זיהוי הממוקם מול הגלאי כדי להשיג הארה נקודתית וזיהוי נקודתי. אור ממקור האור ממוקד בנקודה במישור המוקד של הדגימה על ידי אור הנפלט דרך חריר ההארה, והפלורסנטיות הנפלטת מנקודה זו מצטלמת בתוך חריר הזיהוי, וכל אור הנפלט מחוץ לנקודה זו נחסם על ידי חריר זיהוי. חריר ההארה וחור הזיהוי מצומדים עבור הנקודה המוארת או המזוהה, כך שהנקודה שזוהתה היא הנקודה הקונפוקלית והמישור שבו נמצאת הנקודה המזוהה הוא המישור הקונפוקאלי. המחשב מציג את הנקודה שזוהתה על מסך המחשב בצורה של נקודת תמונה. על מנת להפיק תמונה שלמה, מערכת סריקה בנתיב האופטי סורקת את מישור המוקד של הדגימה, וכך מייצרת תמונה קונפוקלית מלאה. כל עוד שלב הנשא מועבר למעלה ולמטה לאורך ציר ה-Z, רמה חדשה של הדגימה מועברת למישור הקונפוקאלי, והרמה החדשה של הדגימה מצולם על הצג, כאשר ציר ה-Z ממשיך להזיז, מתקבלות תמונות חתוכות אור עוקבות של רמות שונות של המדגם.
המיקרוסקופ האופטי המסורתי משתמש במקור אור שדה, התמונה של כל נקודה בדגימה תופרע על ידי עקיפה או פיזור האור מהנקודות השכנות; מיקרוסקופ קונפוקאלי סריקת לייזר משתמש בקרן לייזר דרך החור המואר כדי ליצור מקור אור נקודתי על הדגימה שנסרקה בכל נקודה של מישור המוקד הפנימי, הדגימה בנקודה המוקרנת, הדמיה של חריר הזיהוי, על ידי זיהוי של חריר. לאחר צינור הכפלה של נקודת האור (PMT) או התקן אלקטרו-צמוד קר (cCCD) מתקבל נקודה אחר נקודה או שורה אחר שורה, תמונה פלורסנטית נוצרת במהירות על מסך צג המחשב. חריר תאורה וחור זיהוי ביחס למישור המוקד של עדשת האובייקט הוא מצומד, הנקודה במישור המוקד בו זמנית מתמקדת בחריר ההארה וחור הפליטה, הנקודה מחוץ למישור המוקד לא תהיה בזיהוי של חריר בהדמיה, כך שהתמונה הקונפוקלית המתקבלת היא החתך האופטי של הדגימה, ומתגברת על החסרונות של תמונת המיקרוסקופ הרגילה מטושטשת.
מהעיקרון הבסיסי, מיקרוסקופ קונפוקאלי לייזר הוא מיקרוסקופ אופטי מודרני, זהו מיקרוסקופ האור הרגיל מהטכנולוגיה כדי לבצע את השיפורים הבאים.
1. השתמש בלייזר כמקור האור מכיוון שהמונוכרומטיות של הלייזר טובה מאוד, אורך הגל של אלומת מקור האור זהה, מה שמבטל את הסטייה הכרומטית באופן יסודי.
2. השימוש בטכנולוגיה קונפוקלית במישור המוקד של עדשת האובייקטיב הממוקמת באמצע עם חור קטן במבצר, מישור המוקד מחוץ לאור התועה חוסם, מבטל את הסטייה הכדורית; ולבטל עוד יותר את הסטייה הכרומטית.
3. מיקרוסקופ לייזר קונפוקאלי באמצעות טכנולוגיית סריקה נקודתית לפירוק הדגימה לחלל דו-מימדי או תלת-ממדי לאינספור נקודות, עם קרן לייזר קטנה מאוד (מקור אור נקודתי) נקודה אחר נקודה, קו אחר קו הדמיה בסריקה, ולאחר מכן דרך שילוב המיקרו-מחשב של מישור שלם או תמונה תלת מימדית. מיקרוסקופ האור המסורתי הוא מקור אור שדה תחת ההדמיה החד-פעמית, דגימות בכל נקודה של התמונה יהיו צמודות לנקודת האור המפוזר והפרעות אור מפוזרות. לא ניתן להשוות את הבהירות והדיוק של שתי התמונות הללו.
4. רכישה ועיבוד של אותות אופטיים עם מחשב והגברה של האותות עם שפופרת פוטו מכפיל
במיקרוסקופ קונפוקאלי לייזר, המחשב מחליף את העין האנושית או המצלמה לצורך תצפית וצילום וידאו, והתמונות המתקבלות עוברות דיגיטציה וניתנות לעיבוד במחשב כדי לשפר שוב את בהירות התמונות. יתר על כן, השימוש בצינורות photomultiplier יכול להגביר אותות חלשים מאוד, ולשפר מאוד את הרגישות. כתוצאה מהשימוש המשולב בטכנולוגיות הנ"ל, ניתן לומר שה-LSCM הוא המיקרוסקופ המתקדם בעולם. ניתן לומר כי LSCM הוא השילוב של טכנולוגיית ייצור מיקרוסקופ, טכנולוגיה פוטו-אלקטרית, טכנולוגיית מחשבים **, היא התוצר הבלתי נמנע של התפתחות הטכנולוגיה המודרנית.
