תכונות אופטיות של מיקרוסקופים ביולוגיים

תכונות אופטיות של מיקרוסקופים ביולוגיים

הביצועים האופטיים של המיקרוסקופ נקבעים על ידי שמונת הפרמטרים האופטיים הבסיסיים (או הפרמטרים):

(1) צמצם מספרי

צמצם מספרי נקרא גם יחס מראה. זה מתייחס למכפלת מקדם השבירה n של המדיום בין האובייקט הנצפה לעדשה ולערך הסינוס של מחצית מזווית עדשת המטרה. השתמש ב-NA או A. כדי לייצג. NA=nsin( /2)
מה שנקרא זווית פה המראה מתייחסת לזווית בין הקרניים השוליות של הנקודה הנצפית הנכנסת לעדשה הקדמית של עדשת האובייקט.

הצמצם המספרי הוא פרמטר חשוב של עדשת האובייקטיב ושל עדשת הקבל, והוא קשור קשר הדוק לפרמטרים אופטיים אחרים של המיקרוסקופ. בדרך כלל מקווים שככל שיותר גדול יותר טוב. ניתן לראות מהנוסחה שיש שתי דרכים להגדיל את הצמצם המספרי, האחת היא הגדלת זווית הפה של המראה, והשנייה היא הגדלת מקדם השבירה בין עדשת המטרה לדגימה.

כאשר השיטה הראשונה מאומצת, ניתן לשמור את הדגימה והאובייקט קרוב ככל האפשר. אבל לא משנה כמה קרוב, הוא תמיד פחות מ-180 מעלות. לפיכך, גם sin( /2) קטן מ-1. מקדם השבירה של האוויר הוא n=1. לכן, הצמצם המספרי nsin(/2) של עדשת האובייקטיב היבשה הוא תמיד קטן מ-1, בדרך כלל בין 0.04 ל-0.95.

כאשר השיטה האחרונה מאומצת, ניתן להוסיף מדיום בעל מקדם שבירה גבוה יותר בין עדשת האובייקטיב לדגימה. לדוגמה, מקדם השבירה של שמן ארז הוא n=1.515. כאשר משתמשים בשמן ארז בתור המדיום, הצמצם המספרי יכול להגיע ליותר מ-1.2. זו הסיבה שבמקרים מסוימים משתמשים במשקפי שמן. נכון לעכשיו, הצמצם המספרי המקסימלי שעדשת השמן יכולה להשיג הוא 1.4.

(2) החלטה

רזולוציה נקראת גם שיעור אפליה או כוח פתרון. הרזולוציה כביכול מתייחסת ליכולת של המיקרוסקופ להבחין במבנה העדין של האובייקט הנבדק. זה ביחס הפוך למרחק הרזולוציה. מרחק הרזולוציה מתייחס למרחק המינימלי בין שתי נקודות אובייקט שניתן להבחין בהן. ככל שמרחק הפתרון קטן יותר, כך הרזולוציה של המיקרוסקופ גבוהה יותר. אם המרחק בין שתי נקודות אובייקט קטן ממרחק הרזולוציה, שתי הנקודות יחשבו בטעות כנקודה אחת, ולא ניתן לראות את המבנה שלה בבירור. הרזולוציה של המיקרוסקופ נקבעת על ידי עדשת האובייקטיב. עיניות רק מגדילות ואינן מגדילות את הרזולוציה של המיקרוסקופ.

במקרה של תאורה מרכזית רגילה, מרחק הפתרון d של עדשת המטרה נקבע על ידי הנוסחה הבאה.

d=(λ/2)N.A.
בנוסחה: d מייצג את מרחק הרזולוציה, היחידה היא מיקרון, λ מייצגת את אורך הגל של אור ההארה, היחידה היא גם מיקרון.

באור נראה, אורך הגל עם הבהירות הגדולה ביותר והרגישות הגבוהה ביותר לעיניים אנושיות הוא {{0}}.55 מיקרומטר, וה-NA המקסימלי של עדשת המטרה הוא 1.4. החלפה לנוסחה לעיל, d הוא בערך 0.2 מיקרומטר. כלומר, עם מיקרוסקופ אופטי רגיל, הגבול של מרחק הרזולוציה הוא 0.2 מיקרומטר במקרה של תאורה מרכזית. כלומר, מיקרוסקופים אופטיים רגילים אינם יכולים להבחין בין שני עצמים קטנים מ-0.2 מיקרומטר.

באמצעות אור אולטרה סגול, ניתן להפחית את אורך הגל של אור ההארה, מה שמאפשר למרחק הרזולוציה להגיע ל-0.1 מיקרומטר. אבל קרניים אולטרה סגולות לא ניתן לראות בעין האנושית. ניתן לצפות בו רק לאחר צילום.

אורך הגל של זרימת האלקטרונים הוא רק 0.00387nm. שימוש ב"עדשת אלקטרונים" או עדשה מגנטית כדי לשלוט בזרימת האלקטרונים, מרחק הרזולוציה של מיקרוסקופ האלקטרונים הוא עד כמה עשיריות ננומטר. זה יכול לשמש כדי לצפות במבנה של אטומים.

(3) הגדלה

ההגדלה של המיקרוסקופ שווה למכפלת ההגדלה של עדשת האובייקטיב וההגדלה של העינית. באופן עקרוני, ניתן להפוך את ההגדלה לגדולה מאוד. עם זאת, אם לא ניתן לפתור את פרטי הדגימה באמצעות עדשת האובייקטיב, לא משנה כמה גדולה ההגדלה היא חסרת משמעות. תיאורטית, ניתן להסיק שההגדלה המתאימה ביותר של המיקרוסקופ (המכונה ההגדלה האפקטיבית, המיוצגת על ידי M ביעילות) היא בין פי 500 ל-1000 מהצמצם המספרי של עדשת האובייקטיב. כלומר, 500N.A. פחות או שווה ל-M יעיל פחות או שווה ל-1000N.A.

בתוך טווח ההגדלה האפקטיבי, העיניים יכולות להתבונן לאורך זמן ללא עייפות. אם ההגדלה נמוכה מ-500 NA, יהיה קשה לצפייה. אם הוא גבוה מ-1000N.A, זה ידרדר את איכות התמונה ואף יגרום לתמונה לא אמיתית. לכן, ההגדלה מעל 1000N.A. נקרא הגדלה לא חוקית.

(4) מרחק עבודה

מרחק העבודה מתייחס למרחק בין המשטח התחתון של עדשת המטרה לבין המשטח העליון של זכוכית הכיסוי לאחר מיקוד המיקרוסקופ, באמצעות זכוכית כיסוי רגילה ואורך צינור מכני סטנדרטי. ככל שההגדלה של עדשת המטרה גבוהה יותר, כך מרחק העבודה קצר יותר. בדרך כלל, מרחק העבודה של עדשת האובייקטיב הקטנה מתחת ל-0 פעמים הוא 5-7 מ"מ, בעוד שמרחק העבודה של עדשת ה-100 פעמים שמן הוא כ-0.19 מ"מ בלבד.

(5) עומק מיקוד

כאשר המיקרוסקופ ממוקד במישור מסוים בדגימה, לא רק את מישור האובייקט ניתן לראות בבירור, אלא גם את מישור האובייקט העליון והתחתון המחוברים אליו ניתן לראות בבירור בו-זמנית. המרחק בין מישור האובייקט העליון והתחתון נקרא עומק המיקוד, או בקיצור עומק המיקוד.

עומק המיקוד של המיקרוסקופ קטן מאוד, וככל שהצמצם המספרי גדול יותר, כך ההגדלה הכוללת גדולה יותר, ועומק המיקוד קטן יותר. לדוגמה, כאשר משתמשים בעדשת שמן עם NA של 1.25/100 פעמים ועינית פי 12.5 לצפייה, עומק המיקוד הוא רק 0.27 מיקרומטר. כלומר, לאחר המיקוד ניתן לראות בכל פעם בבירור רק שכבה דקה בעובי 0.27 מיקרומטר. דגימות רגילות הן בדרך כלל בעובי של כמה מיקרונים. כדי לראות את הדגימה כולה, יש צורך להשתמש במנגנון הכוונון העדין של המיקרוסקופ כדי לצפות בשכבות מלמעלה למטה.

(6) שדה ראייה

שדה הראייה נקרא גם שדה הראייה. מתייחס להיקף האובייקט הנבדק שהמיקרוסקופ יכול לראות בו-זמנית. בדרך כלל אנחנו רוצים ששדה הראייה יהיה כמה שיותר גדול. שדה הראייה של המיקרוסקופ נקבע לפי שדה הראייה של עדשת האובייקטיב ושדה הראייה של העינית. שדה הראייה של עדשת אובייקטיבית רגילה הוא פחות מ-20 מ"מ, והגדולה יכולה להגיע ליותר מ-40 מ"מ. שדה הראייה של עיניות רגילות 10x הוא 14 מ"מ, והגדולות יכולות להגיע ליותר מ-24 מ"מ. ברגע שהאובייקטיב והעינית מתוכננים, שדה הראייה שלהם קבוע. מכיוון ששדה הראייה של מיקרוסקופ כללי קטן, אי אפשר לראות את כל הדגימה בשדה ראיה אחד, ניתן לראות רק עיגול קטן מאוד על הדגימה. יתרה מכך, גודל שדה הראייה עומד ביחס הפוך להגדלה הכוללת של המיקרוסקופ. ככל שההגדלה הכוללת גדולה יותר, כך שדה הראייה קטן יותר. הפתרון הוא להשתמש במנוע כדי לגרום לכל חלק מהדגימה להיכנס לשדה הראייה בתורו ולהתבונן בתורו.

(7) בהירות מראה

בהירות מראה מתייחסת לבהירות ולחושך של תמונת האובייקט הנראית במיקרוסקופ. על מנת להקל על התצפית, אנו מקווים שהתמונה המתקבלת תהיה בהירה יותר. במקרה של אור חיצוני קבוע, בהירות המראה פרופורציונלית לריבוע הצמצם המספרי ופרופורציונלית הפוך לריבוע ההגדלה הכוללת. כדי להפוך את התמונה לבהירה יותר, יש להשתמש בעדשת אובייקטיבית עם צמצם מספרי גדול עם עינית בהגדלה נמוכה. לדוגמה, במקרה של אותה עדשת אובייקטיבית, שימוש בעינית 5X ייצור תמונת מראה בהירה פי 4 מאשר שימוש בעינית 10X.

עבור מיקרוסקופים המשתמשים במקורות אור חשמליים, ניתן לשלוט בבהירות תמונת המראה על ידי התאמת בהירות המאיר.

(8) בהירות

הבהירות של הדמיה במיקרוסקופ תלויה במערכת האופטית שלו, במיוחד בביצועים האופטיים של עדשת האובייקטיב. זה קשור לתכנון, ייצור, שימוש ואחסון של מיקרוסקופים. זה נושא חשוב ומורכב. מנקודת מבט של שימוש ואחסון, הסיבות העיקריות המשפיעות על הבהירות הן: עובי זכוכית הכיסוי המשמשת אינו מתאים, המיקוד אינו מותאם למיקום האידיאלי, ההגדלה הכוללת גדולה מדי ועדשת השמן. העדשה לא נמחקת. נקי, טחב עדשות וכו'.