יתרונות שיפור של מיקרוסקופיה מולטיפוטונים בסריקת לייזר
מיקרוסקופיה מולטיפוטונים סריקת לייזר מייצגת התקדמות גדולה במיקרוסקופיה אופטית. היא מאפשרת תצפית על מבנים עמוקים בתאים חיים, תאים קבועים ורקמות, תוך לכידת מבנים ברורים וחדים במישור Z - כלומר קטעים אופטיים - אשר ניתן להשתמש בהם כדי לשחזר את המבנה המוצק התלת מימדי של דגימות.
מיקרוסקופ קונפוקאלי מאמץ מקור אור לייזר. קרן הלייזר מורחבת כדי להאיר במלואה את מישור המוקד האחורי של עדשת האובייקט, ואז עוברת דרך מערכת עדשות האובייקטיב ומתכנסת לכתם זעיר במיוחד במישור המוקד של הדגימה. בהתאם לצמצם המספרי של עדשת המטרה, קוטר הנקודה המוארת נע בין 0.25 ל-0.8 מיקרומטר בקירוב, עם עומק צירי של כ-0.5 עד 1.5 מיקרומטר. גודל הנקודה הקונפוקלית נקבע על ידי עיצוב המיקרוסקופ, אורך גל הלייזר, מאפיינים אובייקטיביים, הגדרות יחידת הסריקה ומאפייני הדגימה.
מיקרוסקופים רחבי שדה כוללים טווח הארה גדול ועומק הארה עמוק, בעוד שמיקרוסקופיה קונפוקלית מרכזת את ההארה לנקודת מוקד מדויקת במישור המוקד. היתרון המרכזי של מיקרוסקופיה קונפוקלית טמון ביכולתה לבצע חתך אופטי עדין בדגימות פלורסנט עבות (עד 50 מיקרומטר או יותר), כאשר עובי כל קטע נע בין 0.5 ל-1.5 מיקרומטר.
סדרה של תמונות חתך אופטי נרכשות על ידי הזזת הדגימה אנכית באמצעות מנוע הצעד המדויק של ציר Z של המיקרוסקופ. איסוף אותות תמונה מוגבל אך ורק למישור המוקד הממוקד וללא הפרעות על ידי אותות שמקורם במיקומים אחרים בתוך הדגימה. לאחר ביטול הקרינה ברקע ושיפור יחס האות לרעש, תמונות קונפוקאליות מציגות ניגודיות ורזולוציה גבוהים משמעותית בהשוואה לתמונות הקרינה המסורתיות בשדה רחב.
ברוב הדגימות, רכיבים מבניים מורכבים משתלבים זה בזה כדי ליצור מערכות מורכבות. לאחר איסוף מספר מספיק של קטעים אופטיים, ניתן להשלים שחזור תלת מימדי באמצעות תוכנה מקצועית. שיטה ניסיונית זו יושמה באופן נרחב במחקר ביולוגי כדי להבהיר את הקשרים המבניים והתפקודיים המורכבים בין תאים ורקמות.
