כיצד לבחור את מיקרוסקופ הקרינה המתאים
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא ציוד הדמיה מיקרוסקופי סטנדרטי במעבדות ובמחלקות פתולוגיות, המשתמש במאפייני פלואורסצנציה לצורך תצפית והדמיה. הוא נמצא בשימוש נרחב בתחומים שונים כגון ביולוגיה של תאים, נוירוביולוגיה, בוטניקה, מיקרוביולוגיה, פתולוגיה, גנטיקה וכו'. להדמיית פלואורסצנטי יש את היתרונות של רגישות וסגוליות גבוהות, מה שהופך אותו למתאים מאוד לצפייה בהפצה של חלבונים ספציפיים, אברונים וכו'. ברקמות ובתאים, לימוד לוקליזציה משותפת ואינטראקציות, מעקב אחר תהליכים דינמיים בחיים כגון שינויים בריכוז היונים, וכן הלאה.
מבחר מיקרוסקופים
מיקרוסקופי פלואורסצנטי מחולקים בעיקר לשלוש קטגוריות: מיקרוסקופים פלואורסצנטיים זקופים (מתאימים לחיתוך), מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הפוכים (מתאימים לתאים חיים וגם לחיתוך), ומיקרוסקופי פלואורסצנטי סטריאו (מתאימים לדגימות גדולות יותר, כמו צמחים, דג זברה/בוגר עוברי), מדקה, איברי עכבר/עכברושים וכו').
מבחר בלוקי פילטר ניאון
הבחירה של בלוקי סינון צריכה לא רק לשקול את אורכי הגל העירור והפליטה של בדיקות ניאון, אלא גם לשקול האם יש עירור לא ספציפי והאם יש הצלבה צבעונית עבור דגימות עם תווית מרובה צבעים. בניסוי נבחר את אורך הגל הקרוב ביותר לשיא העירור ככל האפשר לצורך עירור, וטווח הקליטה צריך לכלול את שיא הפליטה. שיא העירור של Alexa Fluor 488 הוא 500nm, וניתן לבחור מסנן עירור 480/40 במיקרוסקופ פלואורסצנטי. ניתן לחלק את בלוקי המסנן הפלורסנטיים הנפוצים במיקרוסקופ פלואורסצנטי לשני סוגים: מעבר ארוך (LP) ומעבר פס (BP), שגם אותם יש לבחור בהתאם לצרכים.
מיקרוסקופ קונפוקאלי
בתצפיות מסורתיות במיקרוסקופ פלואורסצנטי, עקב חפיפה של חומרים מסומנים פלואורסצנטיים ומבני פלואורסצנציה ספונטניים, הם קשורים זה לזה בחוזקה. עם זאת, מטרות מסורתיות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי נופל לא רק אוספות אור ממישור המוקד, אלא גם מפזרות אור למעלה ולמטה במישור המוקד, וכתוצאה מכך הפחתה משמעותית ברזולוציית התמונה ובניגודיות.
הדמיה קונפוקלית מזהה רק את האור המוחזר ממישור המיקוד העצמי, ובכך פותרת את הבעיה שלעיל. מקור האור יוצר כתם קטן ועדין במישור המוקד דרך חריר, והאור הנפלט ממישור המוקד נאסף דרך עדשת האובייקט. רוב הקרינה הנפלטת מנקודות מעל או מתחת למישור המוקד של עדשת האובייקט אינה יכולה להתכנס לחור הסיכה. רק הקרינה הממוקמת במישור המוקד וחלק קטן של הקרינה המעורפלת יכולים לעבור דרך החור, בעוד קרן האור מחוץ למישור המוקד מתכנסת לפני או מאחורי לוח החריר ונחסמת מלהיכנס לגלאי דרך החור. התמונה שזוהתה היא ממישור המוקד, כך שאיכות התמונה הסופית משופרת מאוד.
בשל היתרונות השונים והמעשיות של מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר, היא כיום עוזרת ניסויית הכרחית בתחומי ביולוגיה, בוטניקה ומחקר תאים ברמת דיוק גבוהה. יחד עם זאת, במרכזי מחקר מדעיים עתידיים, הוא יהיה כלי המחקר הבסיסי והליבה ביותר.
