כיצד מיקרוסקופיה פלואורסצנטית שונה ממיקרוסקופיה קונבנציונלית
לאחרונה ניסיתי להכין כמה קטעים קפואים של עכברים, ועכשיו אני צריך להשתמש במיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לראות אם הנגיף שהזרקתי נמצא באזור המוח הרצוי. יש ללמוד בקצרה כמה עקרונות בסיסיים של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, ואני גם אשתף אותם כאן.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש באור אולטרה סגול כמקור אור כדי להאיר את האובייקט הנבדק, מה שגורם לאובייקט לפלוט מקור אור, ולאחר מכן לצפות באובייקט מתחת למיקרוסקופ. משמש בעיקר לתאי פלואורסצנטי אימונו, הוא מורכב ממקור אור, מערכת לוחות סינון ומערכת אופטית כדי לצפות בתמונת הקרינה של הדגימה באמצעות הגדלה של העינית ועדשת האובייקטיב. בואו נסתכל על ההבדל בין מיקרוסקופ פלואורסצנטי זה למיקרוסקופ אופטי רגיל.
1. מבחינת שיטות תאורה
שיטת התאורה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא בדרך כלל בשיטת קרן נופלת, כלומר מקור האור מוקרן על דגימת הבדיקה דרך עדשת האובייקטיב.
2. מבחינת רזולוציה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש באור אולטרה סגול כמקור האור, עם אורך גל קצר יחסית אך רזולוציה גבוהה יותר ממיקרוסקופים אופטיים רגילים.
3. הבדלים על המסנן
מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש בשני מסננים מיוחדים, אחד מול מקור האור כדי לסנן את האור הנראה, והשני בין האובייקטיב והעינית כדי לסנן אור אולטרה סגול, שיכול להגן על העיניים.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא גם סוג של מיקרוסקופ אופטי, בעיקר בגלל שאורך הגל הנרגש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית הוא קצר, מה שמוביל להבדלים במבנה ובשימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי ובמיקרוסקופיה רגילה. לרוב מיקרוסקופי הקרינה יש פונקציה טובה של לכידת אור חלש, ולכן יכולת ההדמיה שלהם טובה גם תחת פלואורסצנטי חלש במיוחד. בנוסף, עם השיפור המתמיד של מיקרוסקופ פלואורסצנטי בשנים האחרונות, גם הרעש הופחת משמעותית. לכן, יותר ויותר מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מופעלים.
ידע הקשור למיקרוסקופ פלואורסצנטי של שני פוטונים
העיקרון הבסיסי של עירור שני פוטונים הוא שבצפיפות פוטון גבוהה, מולקולות פלואורסצנטיות יכולות לספוג בו זמנית שני פוטונים באורך גל, ולאחר תקופה קצרה של משך חיים שנקרא מצב מעורר, לפלוט פוטון באורך גל קצר יותר; השפעתו זהה לשימוש בפוטון עם אורך גל של מחצית מאורך הגל הארוך כדי לעורר מולקולות ניאון. עירור שני פוטונים מצריך צפיפות פוטון גבוהה, וכדי להימנע מפגיעה בתאים, נעשה שימוש בלייזר דופק נעול במצב אנרגיה גבוהה במיקרוסקופ דו-פוטונים. ללייזר שפולט לייזר מסוג זה יש אנרגיית שיא גבוהה ואנרגיה ממוצעת נמוכה, עם רוחב פולס של 100 פמט-שניות בלבד ותדר של עד 80 עד 100 מגה-הרץ. כאשר משתמשים באובייקטיבי צמצם מספרי גבוה למיקוד הפוטונים של לייזר פועם, צפיפות הפוטונים במוקד האובייקט היא הגבוהה ביותר, ועירור שני פוטונים מתרחש רק בנקודת המוקד של האובייקט. לכן, מיקרוסקופ שני פוטונים אינו מצריך חורים קונפוקאליים, מה שמשפר את היעילות של זיהוי הקרינה.
בתופעות הקרינה הכלליות, עקב צפיפות הפוטונים הנמוכה של עירור, מולקולת פלואורסצנטית יכולה לספוג רק פוטון אחד בו-זמנית, ולאחר מכן לפלוט פוטון פלואורסצנטי אחד דרך מעבר קרינה, מה שנקרא פלואורסצנטי פוטון בודד. עבור תהליך עירור הקרינה באמצעות לייזר כמקור האור, עשויות להתרחש תופעות פלואורסצנטיות דו-פוטוניות או אפילו רב-פוטוניות. בשלב זה, מקור אור העירור בו נעשה שימוש הוא בעוצמה גבוהה, וצפיפות הפוטונים עונה על הדרישה למולקולות ניאון לקלוט שני פוטונים בו זמנית. בתהליך של שימוש בלייזר טיפוסי כמקור אור עירור, צפיפות הפוטונים עדיין לא מספיקה ליצירת תופעת בליעת שני פוטונים. בדרך כלל, משתמשים בלייזרי דופק של פמט-שנייה, וההספק המיידי שלהם יכול להגיע לרמה של מגה וואט. לכן, אורך הגל של הקרינה של שני פוטונים קצר מזה של עירור, וזה שווה ערך להשפעה שנוצרת על ידי עירור של חצי אורך גל עירור.
