הבדלים בין מיקרוסקופי פלואורסצנטי למיקרוסקופים אור רגילים
מיקרוסקופים פלואורסצנטיים שונים ממיקרוסקופים אופטיים רגילים. במקום לצפות בדגימות עם אור ממקור אור רגיל, הם משתמשים באור באורך גל מסוים (בדרך כלל אור אולטרה סגול או כחול-סגול) כדי לעורר חומרים פלורסנטים בתוך הדגימה בשקופית המיקרוסקופ, מה שגורם לחומרים אלו לפלוט פלואורסצנטיות. לכן, מקור האור של מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו מאיר ישירות את הדגימה; הוא פועל כמקור אנרגיה לעורר את החומרים הפלורסנטים האנדוגניים בדגימה. אנו יכולים לראות את הדגימה לא בגלל הארה ממקור האור עצמו, אלא בגלל שהחומרים הפלורסנטים בתוך הדגימה סופגים את אנרגיית האור העירור ואז פולטים פלואורסצנטיות.
מכאן נובע שהתכונה המרכזית של מיקרוסקופ פלואורסצנטי היא שמקור האור שלו יכול לספק אור עירור ברצועת אורך גל ספציפית, מה שמאפשר לחומרים הפלורסנטיים בדגימה הנבדקת לפלוט פלואורסצנטיות בעוצמה מספקת. בינתיים, מיקרוסקופ פלואורסצנטי חייב להיות מצויד במערכת סינון מתאימה. זהו מכשיר חיוני להיסטוכימיה של פלואורסצנציה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מורכב בעיקר ממקור אור בלחץ גבוה במיוחד, מערכת פילטרים (כולל מסנני עירור ומסנני מחסום), מערכת אופטית ומערכת צילום. זה עובד על ידי שימוש באור באורך גל מסוים כדי לעורר חומרים פלורסנטים.
① שיטות עירור פלואורסצנטי בהתאם לטווח אורכי הגל של אור העירור, ישנם שני סוגים: שיטת עירור UV (שיטת תאורה אולטרה סגולה) ושיטת עירור BV (שיטת תאורה כחולה-סגולה). שיטת עירור UV משתמשת באור אולטרה סגול קצר מ-400 ננומטר לעירור. זה יוצר פלואורסצנטי בלתי נראה, ולכן הקרינה הנצפית מגיעה מהדגימה עצמה. שיטה זו מבדילה בקלות בין הקרינה הספציפית לבין הפלואורסצנטי האוטומטי של הרקע.
② שיטת עירור BV שיטת עירור BV משתמשת באור עירור הנע בין סגול לכחול שבמרכזו 404 ננומטר ו-434 ננומטר. מכיוון שאור כחול משמש להקרנת הדגימה, מערכת מסנן העירור לשיטה זו חייבת לחסום לחלוטין את האור הכחול ולאפשר רק לאור הירוק והצהוב הנדרש לעבור. עבור צביעת נוגדנים ניאון, אורך גל הקליטה המרבי של אור העירור קרוב לאורך הגל המקסימלי של הפליטה של הצבע הפלורסנטי. מסיבה זו, המסנן שנקבע עבור עירור BV חייב להשתמש במסנן מחסום חתוך. שיטה זו משתמשת באור כחול לעירור, כך שיעילות איסוף הקרינה גבוהה יחסית וניתן לקבל תמונות בהירות יותר. החיסרון שלו הוא שלא ניתן לזהות פלואורסצנטיות מעל 500 ננומטר, וניתן לראות רק תמונות צהובות-ירקות מעל 500 ננומטר. בצביעת נוגדנים ניאון, שיקול הספציפיות מסתמך במידה רבה על מידע צבע, כך שהחיסרון של שיטת עירור BV יכול להיות מגבלה עיקרית כאשר דנים בספציפיות עדינה.
