קביעת מספר המיקרואורגניזמים-שיטת ספירה ישירה מיקרוסקופית!
גידול אוכלוסיית החיידקים מתבטא בעלייה במספר התאים או בעלייה בחומר הסלולרי. שיטות לקביעת מספר התאים כוללות ספירה מיקרוסקופית ישירה, ספירת לוחות, הערכת עכירות על ידי ספקטרופוטומטר, מספר MPN הסביר ביותר וסינון ממברנה. (סינון ממברנה) ועוד. שיטות למדידת חומרים תאיים כוללות קביעת משקל התאים היבש, קביעת רכיבי תאים מסוימים כגון תכולת חנקן, תכולת RNA ו-DNA, וקביעת תוצרי מטבוליטים. בקיצור, ישנן שיטות רבות למדידת גידול חיידקים, לכל אחת יתרונות וחסרונות משלה. יש לבחור את השיטה בהתאם לדרישות הספציפיות של העבודה. ניסוי זה מציג בעיקר את שיטת הספירה הישירה במיקרוסקופ הנהוגה בייצור ובעבודות מחקר מדעיות.
1. דרישות תכלית
1. הבהרת עקרון הספירה באמצעות לוח ספירת תאי דם.
2. שלטו בשיטת ספירת מיקרואורגניזמים באמצעות לוח ספירת תאי דם.
2. עקרונות יסוד
שיטת ספירה ישירה במיקרוסקופ היא שיטה פשוטה, מהירה ואינטואיטיבית המציבה כמות קטנה של תרחיף של הדגימה לבדיקה על שקף מיוחד עם שטח ונפח מוגדרים (נקרא גם בקטריומטר) וסופרת אותו ישירות מתחת למיקרוסקופ. שיטות. כיום, בקטריומטרים הנפוצים בארץ ובחו"ל כוללים: המוציטומטר, בקטריומטר Peteroff-Hauser ובקטריומטר הוקסלי וכו'. ניתן להשתמש בכולם לספירת שמרים, חיידקים, נבגי עובש ותרחיפים אחרים, והעקרונות הבסיסיים זהים. לשני מונים החיידקים האחרונים יש נפח כולל של 0.02 מ"מ לאחר כיסוי בזכוכית כיסוי, והמרחק בין זכוכית הכיסוי לשקופית הוא 0.02 מ"מ בלבד. לכן, ניתן להשתמש בעדשת אובייקטיבי טבילה בשמן כדי לצפות ולזהות תאים קטנים יותר כמו חיידקים. לספור. בנוסף לשימוש בבקטריומטרים אלו, קיימת גם שיטת אומדן הצופה ישירות ביחס בין שטח המריחה לאזור שדה הראייה במיקרוסקופ. שיטה זו משמשת בדרך כלל לבדיקה בקטריולוגית של חלב. היתרונות של שיטת הספירה הישירה במיקרוסקופ הם היותה אינטואיטיבית, מהירה וקלה לתפעול. עם זאת, החיסרון בשיטה זו הוא שהתוצאה הנמדדת היא בדרך כלל סך החיידקים המתים והחיידקים החיים. יש כיום כמה שיטות להתגבר על החסר הזה, כמו שילוב של חיידקים ברי-קיימא צובעים תרבית מיקרו-תא (זמן קצר) והוספת מעכבי חלוקת תאים כדי להשיג את המטרה של ספירת חיידקים ברי-קיימא בלבד.
ניסוי זה משתמש בהמוציטומטר כדוגמה לביצוע ספירה ישירה תחת מיקרוסקופ. לשימוש בשני הבקטריומטרים האחרים, יש לעיין בהוראות של כל יצרן. ספירה ישירה תחת מיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר היא שיטת ספירת חיידקים נפוצה. לוח הספירה הוא מגלשה מיוחדת עם ארבעה חריצים היוצרים שלוש פלטפורמות; הפלטפורמה הרחבה יותר באמצע מחולקת לשני חצאים על ידי חריץ אופקי קצר, ויש רשת רשת בכל צד של הפלטפורמה. כל רשת ריבועית מחולקת לתשעה ריבועים גדולים, והריבוע הגדול באמצע הוא חדר הספירה. המבנה של לוח ספירת תאי הדם מוצג באיור {{0}}. יש בדרך כלל שני מפרטים לקנה המידה של תא הספירה. האחד הוא ריבוע גדול המחולק ל-25 ריבועים בינוניים, וכל ריבוע בינוני מחולק ל-16 ריבועים קטנים (איור 15-2); השני הוא ריבוע גדול. הרשת הריבועית מחולקת ל-16 ריבועים בינוניים, וכל ריבוע בינוני מחולק ל-25 ריבועים קטנים. עם זאת, לא משנה באיזה סוג לוח ספירה מדובר, יש 400 ריבועים קטנים בכל ריבוע גדול. אורך הצלע של כל ריבוע גדול הוא lmm, ואז השטח של כל ריבוע גדול הוא lmm2. לאחר כיסוי הכיסוי, הגובה בין הכיסוי למגלשה הוא 0.lmm, כך שנפח תא הספירה הוא 0.lmm3 (אחת עשרת אלפית המיליליטר). איור 15-1 מבנה לוח ספירת תאי הדם (1) איור 15-2 מבנה לוח ספירת תאי הדם (2) א. מבט קדמי; ב. חתך אורך; רשת מרובעת מוגדלת, הריבוע הגדול באמצע הוא תא הספירה 1. לוח ספירת תאי דם; 2. כיסוי כיסוי; 3. כאשר סופרים בתא הספירה, בדרך כלל סופרים את מספר החיידקים הכולל בחמישה ריבועים, ואז מוצאים את הערך הממוצע של כל ריבוע, ואז מכפילים ב-25 או 16 כדי לקבל את המספר הכולל של חיידקים בריבוע גדול לאחר מכן. למספר הכולל של חיידקים ב-1 מ"ל של תמיסה חיידקית. נניח שמספר החיידקים הכולל בחמשת הריבועים האמצעיים הוא A, ומקדם הדילול של תמיסה החיידקית הוא B. אם מדובר בצלחת ספירה עם 25 ריבועים אמצעיים, אז המספר הכולל של חיידקים ב-1 מ"ל של תמיסה החיידקית {{ 23}} A/5×25×104× B=50000A·B (חתיכות) באותו אופן, אם זו לוחית ספירה עם 16 ריבועים, המספר הכולל של חיידקים ב-1mL של תמיסה חיידקית {{ 30}}A/5×16×104×B=32000A·B (חתיכות),,
