סיווג ועבודה של מיקרוסקופים לחקר תאים
המיקרוסקופ הוא הכלי העיקרי להתבוננות בתאים. על פי מקורות אור שונים, ניתן לחלק אותו לשתי קטגוריות: מיקרוסקופים אופטיים ומיקרוסקופים אלקטרוניים. הראשון משתמש באור נראה (מיקרוסקופים UV משתמשים באור אולטרה סגול) כמקור האור, בעוד שהאחרון משתמש בקרני אלקטרונים כמקור האור.
-,מיקרוסקופ אופטי
(1) מיקרוסקופ אופטי רגיל
מיקרוסקופים ביולוגיים רגילים מורכבים משלושה חלקים, כלומר: ① מערכת תאורה, כולל מקור אור וקבל; ② מערכת הגדלה אופטית, המורכבת מעדשת אובייקטיבית ועינית, שהיא הגוף העיקרי של המיקרוסקופ. על מנת לחסל סטייה כדורית ואברציה כרומטית, הן העינית והן האובייקטיבית ③התקן מכני, משמש לתיקון החומר ולהקלה על התצפית (איור 2-1).
האם תמונת המיקרוסקופ ברורה לא נקבעת רק על ידי ההגדלה, אלא גם קשורה לרזולוציה של המיקרוסקופ. הרזולוציה מתייחסת ליכולת של המיקרוסקופ (או העין האנושית להיות במרחק של 25 ס"מ מהמטרה) להבחין בין המרחק הקטן ביותר בין עצמים. גודל הרזולוציה נקבע על ידי יחס אורך הגל והפתח של האור ומקדם השבירה של המדיום באים לידי ביטוי בנוסחה:
בנוסחה: n=מקדם שבירה של מדיום; זווית צמצם=(זווית הפתיחה של הדגימה לצמצם עדשת האובייקט), NA=צמצם עדשה (צמצם מספרי). זווית העדשה היא תמיד פחות מ-180 מעלות, כך שהערך המרבי של sina/2 חייב להיות פחות מ-1.
מקדם השבירה של הזכוכית המשמשת לייצור העדשה האופטית הוא 1.65 עד 1.78, ומקדם השבירה של המדיום המשמש קרוב יותר לזכוכית, ככל שיותר טוב. עבור עדשות אובייקטיביות יבשות, המדיום הוא אוויר, ויחס צמצם העדשה הוא בדרך כלל 0.05 עד 0.95; עבור עדשות שמן, שמן ארז משמש כאמצעי, ויחס צמצם העדשה יכול להיות קרוב ל-1.5.
אורך הגל של אור רגיל הוא {{0}}nm, כך שערך הרזולוציה של המיקרוסקופ לא יפחת מ-0.2μm, והרזולוציה של העין האנושית היא 0.2mm, כך שה ההגדלה המקסימלית של עיצוב המיקרוסקופ הכללי היא בדרך כלל 1000X.
(2) מיקרוסקופ פלואורסצנטי
חלק מהחומרים בתאים, כמו כלורופיל, יכולים להאיר לאחר הקרנות אולטרה סגולות; חלק מהחומרים עצמם אינם יכולים להקרין, אבל אם הם מוכתמים בצבעים ניאון או נוגדנים פלואורסצנטיים, הם יכולים גם להקרין כשהם מוקרנים על ידי קרניים אולטרה סגולות, ומיקרוסקופ הפלורסצנטי (איור 2-2, 3, 4) הוא אחד הכלים למחקר איכותי וכמותי על חומרים כאלה.
למיקרוסקופים פלואורסצנטיים ולמיקרוסקופים רגילים יש את ההבדלים הבאים:
1. שיטת ההארה היא בדרך כלל אפי-תאורה, כלומר מקור האור מוקרן על המדגם דרך עדשת האובייקטיב (איור 2-3);
2. מקור האור הוא אור אולטרה סגול, אורך הגל קצר יותר והרזולוציה גבוהה מזו של מיקרוסקופים רגילים;
3. ישנם שני פילטרים מיוחדים, זה שמול מקור האור משמש לסינון האור הנראה, וזה שבין העינית לעדשת האובייקטיבית משמש לסינון אור אולטרה סגול להגנה על העיניים.
(3) מיקרוסקופ קונפוקאלי סריקת לייזר
מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי בלייזר (מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי לייזר, איור 2-5, 6) משתמש בלייזר כמקור אור סורק, וסורק הדמיה נקודה אחר נקודה, קו אחר קו, משטח אחר משטח, ואוסף הלייזר והפלורסנטיות הסורק חולקים עדשת אובייקטיבית, והמוקד של עדשת האובייקט הוא נקודת המוקד של הלייזר הסורק הוא גם נקודת האובייקט של הדמיה מיידית. מכיוון שאורך הגל של קרן הלייזר קצר והקרן דקה מאוד, למיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקאלי יש רזולוציה גבוהה יותר, שהיא בערך פי 3 מזו של מיקרוסקופ אופטי רגיל. המערכת ממוקדת פעם אחת והסריקה מוגבלת למישור אחד של הדגימה. כאשר עומק המיקוד שונה, ניתן לקבל תמונות של רמות עומק שונות של המדגם. מידע תמונה זה מאוחסן במחשב. באמצעות ניתוח וסימולציה ממוחשבת, ניתן להציג את המבנה התלת מימדי של דגימת התא.
ניתן להשתמש במיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלית לא רק כדי לצפות במורפולוגיה של התא, אלא גם לניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים תוך-תאיים, סטטיסטיקות צפיפות אופטית ומדידה של מורפולוגיה של התא.
(4) מיקרוסקופ שדה אפל
למיקרוסקופ השדה האפל (מיקרוסקופ השדה האפל, איור 2-7) יש יריעת אור במרכז המעבה, כך שאור ההארה לא נכנס ישירות לעדשה האנושית, ורק האור המוחזר ומופרק על ידי הדגימה מותר להיכנס לעדשת האובייקטיב, אז הרקע של שדה הראייה שחור, הקצוות של אובייקטים בהירים. באמצעות מיקרוסקופ זה ניתן לראות חלקיקים קטנים כמו 4-200nm, והרזולוציה יכולה להיות גבוהה פי 50 מזו של מיקרוסקופים רגילים.
(5) מיקרוסקופ ניגודיות פאזה
מיקרוסקופ קונטרסט פאזה (מיקרוסקופ קונטרסט פאזה, איור 2-8, 9) מאת פ. זרניקה הומצא בשנת 1932 וזכה עבורו בפרס נובל לפיזיקה בשנת 1953. התכונה הגדולה ביותר של מיקרוסקופ זה היא שהוא יכול לצפות בדגימות לא מוכתמות ובתאים חיים.
העיקרון הבסיסי של מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הוא לשנות את הפרש הנתיב האופטי של האור הנראה העובר דרך הדגימה להפרש משרעת, ובכך לשפר את הניגודיות בין מבנים שונים ולהפוך מבנים שונים לנראים בבירור. לאחר מעבר דרך הדגימה, האור נשבר, סוטה מהנתיב האופטי המקורי ומתעכב ב-1/4λ (אורך גל). לחזק, להגדיל או להקטין את המשרעת, להגדיל את הניגודיות. מבחינת מבנה, למיקרוסקופים ניגודיות פאזה יש שתי תכונות מיוחדות השונות ממיקרוסקופים אופטיים רגילים:
1. הדיאפרגמה הטבעתית ממוקמת בין מקור האור למעבה, ותפקידה לגרום לאור העובר דרך המעבה ליצור חרוט אור חלול ולהתמקד בדגימה.
2. לוחית הפאזה (לוחית פאזה טבעתית) מוסיפה לוחית פאזה מצופה במגנזיום פלואוריד בעדשת האובייקטיבית, שיכולה לעכב את הפאזה של אור ישיר או אור מפוזר ב-1/4λ. ישנם שני סוגים:
① לוחית פאזה פלוס: האור הישיר מתעכב ב-1/4λ. לאחר שילוב שתי קבוצות גלי האור, מצטרפים את גלי האור ומגדילים את המשרעת. מבנה הדגימה בהיר יותר מהמדיום שמסביב, ויוצר ניגוד בהיר (או ניגוד שלילי).
② B פלוס לוחית פאזה: האור המפוזר מתעכב ב-1/4λ. לאחר שילוב שתי קבוצות הקרניים, גורעים גלי האור, והמשרעת הופכת קטנה יותר, ויוצרת ניגוד כהה (או ניגוד חיובי), והמבנה כהה יותר מהמדיום שמסביב.
