יישום של פלואורסצנטי מיקרוסקופ פלואורסצנטי Total Internal Reflection Fluorescence
TIRFM (Total Internal Reflection Fluorescence Microscope), מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, כאשר אור נכנס לתווך בעל מקדם שבירה נמוך ממדיום בעל מקדם שבירה גבוה, אם זווית הפגיעה גדולה מספיק, כל האור מוחזר ללא שבירה, אבל בממשק של שתי המדיה מייצר גלים נעלמים שיכולים לעורר את הקרינה בתוך 100 ננומטר ליד הממשק כדי לממש את התצפית על פני האובייקט. ניתן לשלוח את אור העירור דרך תאורה של מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונבנציונלי או תאורה מיוחדת, וניתן לשלוט בזווית הפגיעה של הלייזר. שיטת עירור השדה המיידי משמשת למניעת כניסת אור העירור לגלאי. אור העירור בממשק בין זכוכית ומים מייצר פנימי מלא המיושם על ידי השתקפות. בשל ההפחתה האקספוננציאלית של אור העירור, רק אזור הדגימה הקרוב מאוד למשטח ההשתקפות הכולל יפיק השתקפות פלואורסצנציה, מה שמפחית מאוד את ההפרעות של רעשי אור הרקע ליעד התצפית, ולכן טכנולוגיה זו נמצאת בשימוש נרחב בתצפית דינמית של חומרים משטח התא.
דיאגרמה סכמטית של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של השתקפות פנימית כוללת (TIRFM)
①דוגמה ②טווח גלים נעלם ③זכוכית כיסוי ④טבילת שמן ⑤מטרה ⑥קרן פליטה (אות) ⑦קרן עירור
על מנת להשיג השתקפות פנימית מוחלטת, נדרשת זווית תקיפה גדולה, למשל, זווית הפגיעה בממשק הזכוכית-מים גדולה מ-61 מעלות. ניתן להשיג זאת על ידי פריזמה, המכונה TIRFM מבוסס פריזמה, או על ידי עדשת אובייקטיבית בעלת צמצם מספרי גבוה, הנקראת TIRFM מסוג אובייקטיבי. מיקרוסקופי פלואורסצנטי השתקפות פנימיים הממוסחרים הנוכחיים הם בדרך כלל מסוג עדשות אובייקטיביות, במהירות גבוהה ובדיוק גבוה.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי השתקפות פנימי מוחלט נמצא בשימוש נרחב בכמה תחומים ביולוגיים מכיוון שהיא יכולה לממש תצפית פלואורסצנטית בטווח דק מאוד (פחות מ-100 ננומטר) על פני השטח של עצמים. כגון היישומים הבאים:
התבוננות בתמונות משטח התא: מבנה פני קרום התא, מגע פני התא, דינמיקה של פני הממברנה/לוקליזציה של חלבון.
תצפית ומניפולציה של מולקולה אחת: מיוזין, אקטין ו-CY3- ATP המסומנים.
תנועת פני השטח של קרום התא: כגון בליעת שלפוחית, נשיפה של שלפוחית ואקסוקרינית שלפוחית. ה
תצפית על תופעת ניצוצי סידן בממברנת התא, ניטור תעלות יונים.
מחקר מוטורי מולקולרי: מנועים סיבוביים, חלבוני ציטושלד, פולימרים, חלבוני G, חלבוני טבעת, מנועים נוקלאוטידים.
בנוסף לתחום הביולוגיה, יש לו גם יישומים טובים בתחום הכימיה לצפייה במבנים מולקולריים כימיים.
