באיזה סוג של מיקרוסקופ משתמשים כדי לראות את הצורה של תאים מיקרוביאליים
כינוי כולל לכל האורגניזמים הזעירים שקשה ליחידים לצפות בעין בלתי מזוינת. מיקרואורגניזמים כוללים חיידקים, וירוסים, פטריות ומעט אצות. (עם זאת, חלק מהמיקרואורגניזמים נראים לעין בלתי מזוינת, כמו פטריות השייכות לפטריות, Ganoderma lucidum וכו') וירוסים הם סוג של "אורגניזמים לא תאיים" המורכבים מכמה מרכיבים כמו חומצות גרעין וחלבונים, אבל שלהם ההישרדות חייבת להיות תלויה בתאים חיים. לפי הסביבות השונות הקיימות, ניתן לחלק אותם למיקרואורגניזמים פרוקריוטיים, מיקרואורגניזמים בחלל, מיקרואורגניזמים פטרייתיים, מיקרואורגניזמים של שמרים, מיקרואורגניזמים ימיים וכו'.
התפקיד והנזק של מיקרואורגניזמים:
אחת ההשפעות החשובות ביותר של מיקרואורגניזמים על בני אדם היא השכיחות של מחלות זיהומיות. 50 אחוז מהמחלות האנושיות נגרמות על ידי וירוסים. ההיסטוריה של חיידקים הגורמים למחלות אנושיות היא ההיסטוריה של המאבק המתמיד של בני האדם איתם. בני האדם עשו התקדמות רבה במניעה ובטיפול במחלות, אך ממשיכים להתרחש זיהומים מיקרוביאליים חדשים וחוזרים, כמו מספר רב של מחלות ויראליות חסרות תרופות טיפוליות יעילות. המנגנון הפתוגני של מחלות מסוימות אינו ברור. השימוש לרעה במספר רב של אנטיביוטיקה רחבת טווח גרם ללחץ בחירה חזק, גרם למוטציה של זנים רבים, מה שהוביל להופעת עמידות לתרופות, ובריאות האדם מאוימת על ידי איומים חדשים. כמה וירוסים מפולחים יכולים לעבור מוטציה באמצעות ריקומבינציה או מבחר מחדש. הדוגמה האופיינית ביותר היא נגיף השפעת.
לאחר הכרת ההגדרה הספציפית של מיקרואורגניזמים, באיזה סוג של מיקרוסקופ על הנסיין להשתמש כאשר הוא חוקר מיקרואורגניזמים כדי לראות, ובאיזה מיקרוסקופ ניתן להשתמש כדי לראות טוב יותר, ולהתבונן ולנתח צורות מיקרוביאליות נפוצות.
המצאת המיקרוסקופ היא להיות מסוגל לראות עצמים מחייכים שלא ניתן לראות בעין בלתי מזוינת. גודלם של מיקרואורגניזמים קטן מאוד, ולכן יש להגדיל אותם ולצפות בהם בעזרת מיקרוסקופ. בנוסף, ישנם סוגים רבים של מיקרואורגניזמים, כך שבעצם רוב המיקרוסקופים האופטיים יכולים. מיקרוסקופים נפוצים לתצפית על מורפולוגיה מיקרוביאלית כוללים מיקרוסקופים ביולוגיים, מיקרוסקופים ניגודיות פאזה, מיקרוסקופים הפוכים, מיקרוסקופים פלואורסצנטיים ומיקרוסקופים קונפוקאליים. מיקרוסקופ וכן הלאה.
להלן מתארים את המיקרוסקופים השונים המשמשים לצפייה במיקרואורגניזמים:
1. מיקרוסקופ אור רגיל
אור טבעי או אור משמשים כמקור האור, ואורך הגל שלו הוא בערך {{0}}.4 מיקרומטר. הרזולוציה של המיקרוסקופ היא מחצית מאורך הגל, כלומר, 0.2 מיקרומטר, והתמונה הקטנה ביותר הנראית לעין בלתי מזוינת היא 0.2 מ"מ. לכן, שימוש במראה שמן (טבילה) כדי להגדיל פי 1000 יכול להגדיל את חלקיקי 0.2μm ל-0.2 מ"מ הנראים לעין בלתי מזוינת. ניתן להשתמש במיקרוסקופים אופטיים רגילים לתצפית על חיידקים, אקטינומיציטים ופטריות.
2. מיקרוסקופיה Darkfield משמשת בדרך כלל כדי לצפות במורפולוגיה ותנועה של חיידקים לא מוכתמים. לאחר התקנת מעבה השדה הכהה במיקרוסקופ הרגיל, האור אינו יכול לחדור ישירות מהאמצע, ושדה הראייה חשוך. כאשר הדגימה מקבלת אור אלכסוני מקצה המעבה, היא יכולה להתפזר, כך שניתן לצפות במיקרואורגניזמים בהירים ברקע השדה הכהה כגון חיידקים או ספירוצ'טים.
3. מיקרוסקופ ניגודיות שלב מיקרוסקופ ניגודיות שלב משתמש באפקט האור של צלחת הפרש הפאזה כדי לשנות את שלב האור ואת משרעת האור הישיר, ולהמיר את הפרש שלב האור להפרש עוצמת האור. תחת מיקרוסקופ ניגודיות פאזה, כאשר אור עובר דרך דגימה לא מוכתמת, ההבדל בפאזת האור נגרם מחוסר העקביות של הצפיפות של חלקים שונים של הדגימה, וניתן לראות את המורפולוגיה, המבנה הפנימי ואופן התנועה של מיקרואורגניזמים.
4. מיקרוסקופ פלואורסצנטי מיקרוסקופ פלואורסצנטי זהה בעצם למיקרוסקופ אופטי רגיל, ההבדל העיקרי הוא מקור האור, המסנן והקבל. כיום, רובם משתמשים במכשירי אפי-אור, ומנורות כספית בלחץ גבוה משמשות בדרך כלל כמקורות אור, שיכולים לפלוט אור אולטרה סגול או כחול-סגול. ישנם שני סוגים של מסננים: מסנן עירור ומסנן ספיגה. בנוסף למעבים כלליים של שדה בהיר, ניתן להשתמש במעבים של שדה כהה גם במיקרוסקופים פלואורסצנטיים המשתמשים באור כחול כדי לשפר את הניגודיות בין הקרינה לרקע. שיטה זו מתאימה לאיתור או זיהוי של חיידקים מוכתמים בפיגמנטים פלואורסצנטיים או בשילוב עם נוגדנים ניאון.
5. מיקרוסקופים אלקטרונים משתמשים בזרימת אלקטרונים כמקור האור. בהשוואה לאור הנראה, אורך הגל שונה בעשרות אלפי מונים, מה שמשפר מאוד את הרזולוציה. הסליל המגנטי משמש כמערכת ההגברה האופטית, וההגדלה יכולה להגיע לעשרות אלפים או למאות אלפי פעמים. הוא משמש לעתים קרובות בחלקיקי וירוסים. והתבוננות באולטרה-מבנה של חיידקים.
תצפית על דגימות מיקרוביאליות לא מוכתמות:
בדרך כלל ניתן להשתמש בדגימות לא מוכתמות כדי לצפות במורפולוגיה, כוח ותנועה של חיידקים. חיידקים הם חסרי צבע ושקופים כאשר אינם מוכתמים, והם נצפים במיקרוסקופ בעיקר על ידי ההבדל בין מקדם השבירה של החיידקים והסביבה הסובבת. חיידקים עם דגלים נעים במרץ, בעוד שחיידקים ללא דגלים מראים תנועה בראונית לא סדירה. לחיידקים ברי קיימא כגון Treponema pallidum, Leptospira ו- Campylobacter יש צורות ודפוסי תנועה ייחודיים, שהם בעלי משמעות אבחנתית. השיטות הנפוצות הן שיטת ירידת לחץ, שיטת נפילת תליון ושיטת נימי.
1. שיטת טיפת תלייה יש למרוח וזלין סביב החור הקעור של שקף הזכוכית הקעור הנקי, לקחת טבעת של תרחיף חיידקים עם לולאת חיסון ולשים אותה במרכז זכוכית הכיסוי, ואז ליישר את החור הקעור של שקף הזכוכית הקעור עם הטיפה במרכז זכוכית הכיסוי והלביש את הכיסוי, לאחר מכן הפוך אותו במהירות, לחץ קלות על כיסוי הכיסוי כדי לגרום לו להיצמד בחוזקה לווזלין בקצה החור הקעור, ולאחר מכן התבונן בעוצמה גבוהה מיקרוסקופ (או שדה אפל).
2. לוקחים טבעת תרחיף חיידקים עם לולאת חיסון ומניחים במרכז שקף זכוכית נקי בשיטת ירידת לחץ ומכסים בעדינות את תרחיף החיידקים בכוס כיסוי תוך הקפדה על יצירת בועות אוויר ומניעת יצירת בועות אוויר. תרחיף החיידקים מלעלות על גדותיו. תצפית בשדה הבהיר (או Darkfield) תחת עדשה בעלת עוצמה גבוהה.
3. שיטת הנימים משמשת בעיקר לבחינת הקינטיקה של חיידקים אנאירוביים. בדרך כלל בחר באורך של 60~70מ"מ. לאחר סיפוק תרחיף החיידקים האנאירוביים דרך נימי עם פתח של 0.5-1.0 מ"מ, אטום את שני קצוות הנימים בלהבה. הנימים היו מקובעים על שקף הזכוכית עם נייר פלסטיק, ונצפה מתחת לעדשה בעלת עוצמה גבוהה בשדה חשוך.
תצפית על דגימות מיקרוביאליות מוכתמות עם מיקרוסקופ:
לאחר צביעה של דגימת החיידק, עקב הניגוד החד בצבע בין החיידקים לסביבה, ניתן להבחין במאפיינים המורפולוגיים של החיידקים (כגון גודל, צורה, סידור וכו') של החיידקים וכמה מבנים מיוחדים. נצפה בבירור תחת מיקרוסקופ אופטי רגיל (כגון קפסולות, דגלים, נבגים וכו'), וניתן לסווג ולזהות את החיידקים בהתאם לתגובתיות הצביעה.
(1) הליך כללי של צביעת חיידקים ההליך הכללי של צביעת חיידקים הוא: מריחה (ייבוש) - קיבוע - צביעה.
1. מריחה הכנת דם, הפרשות, הפרשות, ניקוב נוזלים ותרבית נוזלים, ומריחות סרט דק ישירות על שקופיות זכוכית; נתיחה או רקמות נגועות של בעלי חיים, למרוח את הנגע עם צמר גפן לדגימה. להכנת מושבות חיידקים או מדשאות על מדיום מוצק, השתמש תחילה בלולאת חיסון כדי לקחת טבעת של תמיסת מלח רגילה ולשים אותה במרכז השקופית, ולאחר מכן השתמש בלולאת חיסון סטרילית כדי לקחת כמות קטנה של תרבית ולטחון אותה. באופן שווה בתמיסת מלח רגילה, ופזרו אותו למשטחים צבועים גדולים או קטנים בגודל 1 ס"מ, הניחו לו להתייבש בטמפרטורת החדר או להתייבש לאט ממרחק.
2. מטרת הקיבוע היא להרוג חיידקים, להקריש חלבון ומבנה חיידקים ולהקל על צביעה; לקדם חיידקים להיצמד לשקופית כדי להימנע משטיפה במים במהלך הכביסה; לשנות את החדירות של חיידקים לצבעים, דבר המועיל למבנה של תאי חיידקים של צביעה. בדרך כלל הוא מקובע על ידי חימום עם להבה, והמריחה המיובשת מועברת במהירות דרך הלהבה במשך 3 פעמים. עדיף לא לשרוף את העור בגב היד כשהיא נוגעת בשקופית.
3. צביעה לפי מטרות בדיקה שונות, בחר שיטות צביעה שונות לצביעה. בעת הצביעה, הוסף את תמיסת הצבע בצורה טיפה כדי להגדיל את הכיסוי.
4. מבסס כל חומר שיכול לשפר את הזיקה בין הצבע לחפץ הצבוע, לקבע את הצבע על החפץ הצבוע ולגרום לשינוי בחדירות קרום התא נקרא מורדנט. בשימוש נפוץ אלום, חומצה טאנית, מלחי מתכת ויוד וכו', וחימום משמש גם לקידום צביעה. ניתן להשתמש בחומרי ליטוש בין צביעה ראשונית לצביעה נגדית, וניתן להשתמש בהם גם לאחר קיבוע או להכיל בקיבוע ובצביעה.
5. דה-צבע כל חומר כימי שיכול להסיר את צבעו של החפץ הצבוע נקרא מסיר צבע. אתנול, אצטון וכו' משמשים בדרך כלל כמסירי צבע. חומר מסיר הצבע יכול לזהות את מידת היציבות של שילוב החיידקים והצבעים, שניתן להשתמש בהם לצביעה דיפרנציאלית.
6. חיידקי צביעת נגד או המבנים שלהם שעברו דה-צבע מוצבעים לעתים קרובות עם תמיסת צביעת נגד לצורך התבוננות קלה. הצבע של תמיסת צביעה נגדית שונה מזה של תמיסת הצביעה הראשונית כדי ליצור ניגודיות חדה. הצביעה הנגדית לא צריכה להיות חזקה מדי, כדי לא לכסות את צבע הצביעה הראשונית.
