שיטת התצפית העיקרית של מיקרוסקופ אופטי היא תצפית פלואורסצנציה

שיטת התצפית העיקרית של מיקרוסקופ אופטי היא תצפית פלואורסצנציה

תופעת הקרינה

Fluorescence refers to the process in which a fluorescent substance emits light with a longer wavelength almost simultaneously when irradiated with light of a specific wavelength (Figure 1). When light of a specific wavelength (excitation wavelength) strikes a molecule (such as a molecule in a fluorophore), the photon energy is absorbed by the molecule's electrons. Next, the electrons transition from the ground state (S0) to a higher energy level, the excited state (S1'). This process is called excitation①. The electron stays in the excited state for 10-9–10-8 seconds, during which the electron loses some energy ②. In the process of leaving the excited state (S1) and returning to the ground state ③, the remaining energy absorbed during the excitation process will be released.

זמן השהייה של מולקולת פלואורסצנטי במצב נרגש הוא משך חיי הקרינה, בדרך כלל בננו-שניות, שהוא מאפיין אינהרנטי של מולקולת הפלורסנט עצמה. טכנולוגיית ההדמיה באמצעות חיי פלואורסצנציה נקראת Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM), שיכולה לבצע מדידות פונקציונליות ומדויקות יותר מעמיקות בנוסף להדמיית עוצמת הקרינה כדי להשיג קונפורמציה מולקולרית, אינטראקציות בין-מולקולריות ומיקרו-סביבות מולקולריות. מידע שקשה להשיג בהדמיה אופטית קונבנציונלית.

תכונה חשובה נוספת של הקרינה היא הסטוק סטוקס, ההבדל באורך הגל בין שיאי העירור והפליטה (איור 2). בדרך כלל אורך הגל של אור הפליטה ארוך יותר מאורך הגל של אור העירור. הסיבה לכך היא שלאחר ריגוש החומר הפלורסנטי ולפני שחרור הפוטון, האלקטרונים יאבדו חלק מהאנרגיה בתהליך ההרפיה. קל יותר לראות חומרים פלואורסצנטיים עם תזוזות סטוקס גדולות יותר תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

מיקרוסקופים פלואורסצנטי ובלוקים מסנן פלואורסצנטי

מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא מיקרוסקופ אופטי המשתמש בתכונות פלואורסצנטיות לצפייה ולדימוי, ונמצא בשימוש נרחב בביולוגיה של התא, נוירוביולוגיה, בוטניקה, מיקרוביולוגיה, פתולוגיה, גנטיקה ותחומים נוספים. להדמיית פלואורסצנציה יתרונות של רגישות גבוהה וסגוליות גבוהה, והיא מתאימה מאוד לצפייה בהתפלגות חלבונים ספציפיים, אברונים וכו' ברקמות ובתאים, חקר שיתוף לוקליזציה ואינטראקציה ומעקב אחר דינמי החיים בחיים. תהליכים כגון שינויים בריכוז היונים.

רוב המולקולות בתאים אינן מקרינות, וכדי לראות אותן יש לסמן אותן בצורה פלואורסצנטית. ישנן שיטות רבות של תיוג ניאון, שניתן לסמן ישירות (כגון שימוש ב-DAPI לתיוג DNA), או צביעה חיסונית באמצעות תכונות קושרות האנטיגן של נוגדנים, או שניתן לתייג את חלבון המטרה בחלבונים ניאון (כגון GFP, ירוק חלבון ניאון), או קשירה הפיכה. צבעים סינתטיים (כגון Fura-2) וכו'.

כיום, מיקרוסקופ הקרינה הפך לציוד ההדמיה הסטנדרטי של מעבדות ופלטפורמות הדמיה שונות, והוא עוזר טוב לניסויים היומיומיים שלנו. מיקרוסקופים פלואורסצנטיים מחולקים בעיקר לשלוש קטגוריות: מיקרוסקופים פלואורסצנטיים זקופים (מתאימים לחיתוך), מיקרוסקופים פלואורסצנטיים הפוכים (מתאימים לתאים חיים, תוך התחשבות בחתכים), מיקרוסקופים סטריאוסקופיים פלואורסצנטיים (מתאימים לדגימות גדולות יותר, כגון צמחים, דג זברה (מבוגרים/ עובר), מדקה, איברי עכבר/עכברושים וכו').

בלוק מסנן הקרינה הוא מרכיב הליבה של הדמיית פלואורסצנטי במיקרוסקופים. הוא מורכב ממסנן עירור, מסנן פליטה ומפצל אלומה דיכרואי. הוא מותקן בגלגל המסנן, כגון Leica DMi8 המצויד בגלגל סינון של 6-מיקום (איור 3). ). למיקרוסקופים שונים יש מיקומי גלגלים שונים, ומיקרוסקופים מסוימים משתמשים בשקופיות סינון.

בלוק המסנן ממלא תפקיד חשוב בהדמיית פלואורסצנציה: מסנן העירור בוחר את אור העירור כדי לעורר את הדגימה וחוסם אורכי גל אחרים של אור; האור העובר דרך מסנן העירור עובר דרך מפצל קרני דיכרואי (תפקידו לשקף את אור העירור ולהעביר את הקרינה), לאחר השתקפות, הוא ממוקד על ידי עדשת האובייקט, מוקרן לדגימה, והקרינה המתאימה מתרגשת ל פולטים אור. האור הנפלט נאסף על ידי עדשת האובייקטיב, עובר דרך מפצל האלומה הדיכרואי ומגיע למסנן הפליטה. כפי שמוצג באיור 4: אורך גל העירור הוא 450-490nm, מפצל האלומה הדיכרואי מחזיר אור קצר מ-510nm, מעביר אור ארוך מ-510nm, וטווח קליטת האור הפליטה הוא 520-560nm.

ניתן לחלק את מסנני הקרינה הנפוצים במיקרוסקופים פלואורסצנטיים לשני סוגים: מעבר ארוך (LP בקיצור) ומעבר פס (BP בקיצור). מעבר הפס נקבע בדרך כלל על ידי אורך הגל המרכזי ורוחב המרווח, כגון 480/40, כלומר ניתן להעביר אור מ-460-500nm. מסנני Longpass, כגון 515 LP, מעבירים אור עם אורכי גל ארוכים מ-515 ננומטר (איור 5).

לחומרים פלורסנטים יש עקומת עירור (ספיגה) ועקומת פליטה האופיינית להם, שיא העירור הוא אורך גל העירור האידיאלי (יעילות עירור גבוהה, שיכולה להפחית את אנרגיית אור העירור, להגן על תאים וצבעים), ועקומת הפליטה היא אורך גל הקרינה הפליטה טווח. לכן בניסוי נבחר את אורך הגל קרוב ככל האפשר לשיא העירור לעירור, וטווח הקליטה צריך לכלול את שיא הפליטה. לדוגמה, שיא העירור של Alexa Fluor 488 הוא 500nm, וניתן לבחור את מסנן העירור של 480/40 במיקרוסקופ הקרינה.

ניתן לראות פרטים על קוביות המסנן בתוכנת ההדמיה במיקרוסקופ. הבנת הצבעים ומציאת המסנן המתאים ביותר לדגימה שלך היא קריטית להדמיית פלואורסצנציה. המידע הספקטרלי של צבעים פלואורסצנטיים וחלבונים ניאון מצוין בדרך כלל בהוראות, וניתן למצוא אותו גם באינטרנט.

בנוסף לאורכי הגל של העירור והפליטה של ​​בדיקות ניאון, הבחירה של בלוקי מסנן צריכה לשקול גם האם יש עירור לא ספציפי והאם יש צבע צלב עבור דגימות מסומנות בצבעים. בנוסף, יש צורך לשקול את מקור האור הפלורסנט המשמש. כיום, מקורות האור הפלורסנט הנפוצים כוללים מנורות כספית, מנורות הליד מתכת ומקורות אור LED שהתפתחו במהירות בשנים האחרונות. הספקטרום של מקור אור ניאון הוא רציף או בלתי רציף, והאנרגיה תהיה שונה בפסי אורכי גל שונים. מקור אור LED הופך בהדרגה למקור האור העיקרי של מיקרוסקופ הקרינה הודות לפס הספקטרלי הצר יחסית שלו, תפוקת אנרגיה יציבה יותר, אורך חיים ארוך, בטוח יותר והגנה על הסביבה ויתרונות רבים אחרים.

בנוסף לבלוק הסינון המובנה של המיקרוסקופ, יש גם גלגל מהיר חיצוני (איור 7). מהירות ההמרה של המסנן הסמוך לגלגל המהיר החיצוני של Leica היא 27ms, מה שיכול לממש ניסויים מרובים בצבעים במהירות גבוהה, כגון הדמיית סידן ביחס FRET ו-Fura2. (איור 8) וחב'.

מגוון רחב של טכניקות הדמיה במיקרוסקופ פלואורסצנטי

על מנת לענות על צורכי הדמיית פלואורסצנציה שונים, פותחו בנוסף למיקרוסקופים פלואורסצנטיים פתרונות הדמיה שונים במיקרוסקופ פלואורסצנטי:

מערכות הדמיה בחדות גבוהה בשדה רחב, כגון Leica THUNDER Imager, משתמשות בטכנולוגיית Clearing החדשנית של Leica להסרה יעילה של אותות הפרעות במישור לא-מוקד במהלך ההדמיה, תוך הצגת תמונות ברורות ואת היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה;

מיקרוסקופ סריקת הלייזר הקונפוקאלי משתמש בחורים כדי לחסל הפרעות מישור לא מוקד, מממש חתך אופטי ומשיג תמונות בחדות גבוהה ותמונות תלת מימדיות;

מיקרוסקופים ברזולוציה גבוהה במיוחד וננו-מיקרוסקופים הפורצים את גבול העקיפה יכולים לצפות במבנים עדינים הקטנים מ-200 ננומטר;

מערכת הדמיה מולטיפוטונים המשתמשת בעקרון עירור מולטיפוטונים להדמיה של רקמה עבה ועמוק in vivo;

טכנולוגיית הדמיית גיליון קלה עם רזולוציה זמנית ומרחבית גבוהה, מהירות הדמיה מהירה, רזולוציה גבוהה, פוטוטוקסיות נמוכה, מתאימה במיוחד למחקר על פיתוח ותצפית דינמית in vivo;

הדמיית חיים פלואורסצנטית (FLIM), שאינה מושפעת מגורמים כגון ריכוז חומר ניאון, הלבנת צילום, עוצמת אור עירור וכו', יכולה לבצע מדידות פונקציונליות ומדויקות יותר מעמיקות;

ספקטרוסקופיה של מתאם פלואורסצנטי (FCS) וספקטרוסקופיה צולבת פלואורסצנציה (FCCS), מודדים את המספר המולקולרי ומקדם הדיפוזיה של מולקולות פלואורסצנטיות, ובכך מנתחים ריכוז מולקולרי, גודל מולקולרי, צמיגות, תנועה מולקולרית, מאפיינים אופטיים מולקולריים ומאפיינים אופטיים מולקולריים;

מיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית מלאה (TIRF), עם רזולוציית ציר Z גבוהה במיוחד, היא אידיאלית לחקר המבנה המולקולרי והדינמיקה של משטחי קרום התא.