ההבדל בין מיקרוסקופ הקרינה (דו-פוטון, קונפוקלי)
העיקרון הבסיסי של עירור דו-פוטון הוא שבצפיפות פוטון גבוהה, מולקולות פלואורסצנטיות יכולות לספוג בו זמנית שני פוטונים באורך גל ארוך ולפלט פוטון אורך גל קצר יותר לאחר תקופה קצרה של חיי מצב נרגשים שנקראו; ההשפעה זהה לשימוש בפוטון עם מחצית אורך הגל של אורך הגל הארוך כדי לרגש מולקולות פלורסנטיות. שני עירור פוטון דורש צפיפות פוטון גבוהה, וכדי להימנע מתאים מזיקים, מיקרוסקופיה דו-פוטונית משתמשת בלייזרי דופק בעלי נעילה בעלת אנרגיה גבוהה. הלייזר הנפלט על ידי לייזר זה הוא בעל אנרגיה שיא גבוהה ואנרגיה ממוצעת נמוכה, עם רוחב דופק של 100 פנטו -שניות בלבד ותדר של עד 80 עד 100 מגה -הרץ. כאשר משתמשים בעדשה אובייקטיבית של צמצם מספרי גבוה כדי למקד את הפוטונים של לייזר פועם, צפיפות הפוטון בנקודת המוקד של העדשה האובייקטיבית היא הגבוהה ביותר, ועירור דו-פוטון מתרחש רק בנקודת המוקד של העדשה האובייקטיבית. לפיכך, המיקרוסקופ הדו-פוטון אינו דורש חור סיכה קונפוקלי, מה שמשפר את היעילות של גילוי הקרינה.
באופן כללי תופעות פלואורסצנטיות, עקב צפיפות הפוטון הנמוכה של אור העירור, מולקולת פלורסנט יכולה לספוג רק פוטון אחד בכל פעם ואז לפלוט פוטון פלורסנט אחר באמצעות מעבר קרינה, המכונה פלואורסצנט פוטון יחיד. לתהליכי עירור פלואורסצנטי המשתמשים בלייזרים כמקורות אור, עלולות להופיע תופעות פלואורסצנטיות דו-פוטוניות או אפילו מרובות-פוטון. במקרה זה, למקור האור המעורר המשמש יש עוצמה גבוהה וצפיפות פוטון העומדת בדרישה למולקולות פלואורסצנטיות לספוג שני פוטונים בו זמנית. בתהליך השימוש בלייזר כללי כמקור אור עירור, צפיפות הפוטון עדיין אינה מספיקה בכדי לייצר תופעת ספיגת דו-פוטונים. בדרך כלל משתמשים בלייזרי דופק femtosecond, כאשר כוח מיידי מגיע לרמת המגוואט. לפיכך, אורך הגל של פלואורסצנציה של שני פוטונים הוא קצר יותר מזה של אור עירור, שווה לאפקט המיוצר על ידי עירור באורך גל של עירור.
ידע הקשור למיקרוסקופיית פלואורסצנציה קונפוקלית
העיקרון הבסיסי של מיקרוסקופיית הקרינה הקונפוקלית הוא להשתמש במקור אור נקודה כדי להקרן את הדגימה, ויוצר נקודת אור קטנה מוגדרת היטב במישור המוקד. הקרינה הנפלטת מנקודה זו לאחר ההקרנה נאספת על ידי העדשה האובייקטיבית ונשלחת חזרה לאורך מסלול ההקרנה המקורי למפצל הקורה המורכב ממראה דיכרואית. הספקטרומטר שולח פלואורסצנט ישירות לגלאי. יש חור חור מול מקור האור וגם הגלאי, הנקרא חור התאורה וגם חור הגילוי, בהתאמה. הממדים הגיאומטריים של השניים עקביים, בערך 100-200 nm; בהשוואה לנקודת האור במישור המוקד, השניים מצומדים, כלומר נקודת האור עוברת דרך סדרת עדשות ויכולה בסופו של דבר להתמקד הן בפינה האיר והן על חור הגילוי בו זמנית. באופן זה, אור ממישור המוקד יכול להתכנס בטווח חור הגילוי, ואילו אור מפוזר מלמעלה או מתחת למישור המוקד נחסם מחוץ לחור הגילוי ולא ניתן לצלם אותו. סריקת נקודת הדגימה אחר נקודה עם לייזר, הצינור הצילומי -מכוסה לאחר גילוי חור החור משיג גם את התמונה הקונפוקלית המתאימה של נקודת נקודת האור אחר נקודה, הופכת אותה לאות דיגיטלי ומעבירה אותה למחשב, ולבסוף מצטברת אותה לתמונה קונפוקלית ברורה של מישור המוקד כולו על המסך.
