עקרונות של מיקרוסקופ פלואורסצנטי
מיקרוסקופים פלואורסצנטיים שונים ממיקרוסקופים אופטיים רגילים. במקום לצפות בדגימות תחת תאורה של מקורות אור רגילים, הם משתמשים באור באורך גל מסוים (בדרך כלל אור אולטרה סגול, אור כחול-סגול) כדי לעורר את החומרים הפלורסנטים בדגימות מתחת למיקרוסקופ כדי לגרום להם לפלוט פלואורסצנטיות. לכן, מקור האור של מיקרוסקופ פלואורסצנטי אינו מתפקד כהארה ישירה, אלא כמקור אנרגיה שמלהיב את החומרים הפלורסנטיים בתוך הדגימה. הסיבה שבגללה אנו יכולים לצפות בדגימה נובעת מהארת מקור האור, אך תופעת הקרינה המוצגת לאחר שהחומר הפלורסנטי בדגימה סופג את אנרגיית האור הנרגשת.
ניתן לראות כי המאפיין של מיקרוסקופ הקרינה הוא שמקור האור שלו יכול לספק כמות גדולה של אור עירור בטווח אורכי גל מסוים, כך שהחומר הפלורסנטי בדגימה הנבדקת יכול לקבל את אור העירור בעוצמה הדרושה. יחד עם זאת, מיקרוסקופ הקרינה חייב להיות בעל מערכת הסינון המתאימה.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא כלי חיוני בהיסטוכימיה של אימונופלואורסצנטי. הוא מורכב ממקור אור במתח גבוה במיוחד, מערכת סינון (כולל פלטת סינון עירור ודיכוי), מערכת אופטית ומערכת צילום ורכיבים עיקריים אחרים. הוא משתמש באור באורך גל מסוים כדי לעורר את הדגימה כדי לפלוט פלואורסצנטיות.
הדרך לעורר את הקרינה: לפי טווח אורכי הגל של האור, ניתן לחלק אותה לשני סוגים: שיטת עירור UV (בשיטת תאורה אולטרה סגולה) ושיטת עירור BV (שימוש באור כחול-סגול). שיטת עירור UV משתמשת באור כמעט אולטרה סגול קצר מ-400 ננומטר לצורך עירור. אין אור עירור גלוי בשיטה זו, ולכן הקרינה הנצפית מציגה את הקרינה המובנית של הצבע, וקל להבחין בין הקרינה הספציפית על הדגימה לבין הקרינה האוטו-פלואורסנטית של רקמת הרקע.
שיטת עירור BV מבוססת על 404nm ו-434nm לעירור מאור אולטרה סגול לכחול. שיטה זו משתמשת באור כחול כדי להקרין את הדגימה, ולכן מסנן הניתוק של מערכת תצפית הקרינה חייב להשתמש במסנן שיכול לחסום לחלוטין את האור הכחול ולעבור במלואו את הקרינה הירוקה והצהובה הנדרשת. צבעים פלורסנטים למבחני נוגדנים ניאון. אורך הגל המקסימלי של קליטה של אור עירור קרוב יחסית לאורך הגל המקסימלי של הפליטה של הקרינה, ולכן המסנן המשמש בשיטת עירור BV חייב להשתמש במסנן חתוך חד. בשיטה זו ניתן להשתמש באור כחול כאור העירור, כך שיעילות הספיגה של הפיגמנט הפלורסנטי גבוהה יותר, וניתן לקבל תמונה בהירה יותר. החיסרון שלו הוא שלא ניתן לראות את הקרינה מתחת ל-500nm, והקרינה מעל 500nm גורמת לכל התמונה להיראות צהובה. בשיטת הנוגדנים הפלורסנטיים, הספציפיות של הפלואורוכרום נשפטת לרוב לפי הצבע הייחודי לפלואורוכרום. לכן, כאשר דנים בספציפיות עדינה, לחסרונות שהוזכרו לעיל של שיטת עירור BV יש לרוב השפעה רבה.
לסיכום, ניתן לשקול את הארת מיקרוסקופ הקרינה לפי שלוש הנקודות הבאות לפי מבנה המעבה ואורך הגל של אור העירור.
① מנקודת המבט של דרישות הניגודיות של תמונת הפלורסנט, מרכז השדה הכהה של עירור UV משמש להארה.
② בהתחשב בבהירות התמונה, למסנן עירור BV יש את יעילות התצפית הגבוהה ביותר בשדה כהה.
③ ניתן להתייחס למאפיינים של תצפית שדה כהה מסנן עירור UV ותאורת מרכז שדה כהה עירור BV כמו בין שתי שיטות ההארה הללו, אך לראשונה יש תכונות שדה כהה חזקות יותר ומציגה תמונות בהירות יותר. הניגוד קטן; האחרון שומר על המאפיינים של נתיב האור בשדה כהה, כך שהתמונה המוצגת כהה יותר והניגודיות משתפרת. בעת שימוש בפועל במיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש להשתמש בשיטת ההארה המתאימה ביותר לדרישות הדגימה לצורך תצפית.
יש לציין שגם אם מעבה השדה הכהה מעורר UV עם הניגודיות הטובה ביותר מואר, חלק מאור העירור האולטרה סגול שנשבר או מפוזר על ידי הדגימה ייכנס לעדשת האובייקטיב. Autofluorescence יכול להחמיר את תגובת התמונה. לכן, יש להשתמש בפילטר סופג UV מול העינית כמסנן חתוך.
