עקרונות של מיקרוסקופיה קונפוקלית
מיקרוסקופ קונפוקאלי הוא מכשיר הדמיה בעל דיוק גבוה שהופיע והתפתח בשנות ה-80, והוא מכשיר מחקר מדעי חיוני לחקר מבנים תת-מיקרוניים. עם התפתחות המחשבים, תוכנות עיבוד התמונות והלייזרים, גם המיקרוסקופים הקונפוקאליים עברו התפתחות רבה, וכיום נעשה בהם שימוש נרחב בתחומי הביולוגיה, המיקרו-מערכות ומדידות החומר. מיקרוסקופ קונפוקאלי הוא סוג חדש של מיקרוסקופ המשלב עיקרון קונפוקאלי, טכנולוגיית סריקה וטכנולוגיית עיבוד גרפיקה ממוחשבת. היתרונות העיקריים שלו הם: רזולוציה צידית גבוהה ורזולוציה צירית גבוהה, ודיכוי יעיל של אור תועה, עם ניגודיות גבוהה.
מערך מיקרוסקופ קונפוקאלי טיפוסי הוא למקם שני חורים קטנים במישור המצומד של מישור המוקד של האובייקט הנמדד, שאחד מהם ממוקם מול מקור האור והשני ממוקם מול הגלאי, כפי שמוצג באיור. 1. ניתן לראות מהאיור שכאשר המדגם הנמדד נמצא במישור הכמו-פוקוס, עוצמת האור הנאספת על ידי קצה הזיהוי היא הגדולה ביותר; כאשר המדגם הנמדד נמצא במצב לא ממוקד, כתם האור בקצה הזיהוי מתפזר ועוצמת האור יורדת במהירות. לכן, רק האור הנפלט מנקודות במישור המוקד יכול לעבור דרך חריר היציאה, בעוד שהאור הנפלט מנקודות מחוץ למישור המוקד אינו ממוקד במישור החור המוצא, ורובם לא יכולים לעבור דרך החור המרכזי. לכן, נקודת יעד התצפית במישור המוקד נראית בהירה, ונקודת התצפית שאינה נראית שחורה כרקע, מה שמגדיל את הניגודיות ומנקה את התמונה. במהלך תהליך ההדמיה, שני החורים הם קונפוקאליים, הנקודה הקונפוקלית היא הנקודה שזוהתה, והמישור שבו נמצאת הנקודה המזוהה הוא המישור הקונפוקאלי.
גודל החריר בגלאי במיקרוסקופיה קונפוקלית משחק תפקיד קריטי. זה משפיע ישירות על הרזולוציה ויחס האות לרעש של המערכת. אם החיר גדול מדי, אפקט הזיהוי הקונפוקאלי לא יושג, מה שלא רק מפחית את הרזולוציה של המערכת, אלא גם מכניס יותר אור תועה; אם החור קטן מדי, זה יפחית את יעילות הזיהוי ויקטין את התמונה המיקרוסקופית. בְּהִירוּת. מחקרים הראו שכאשר קוטר החריר שווה לקוטר ה- Airy disk, מתקיימים הדרישות הקונפוקאליות, ויעילות הזיהוי אינה מופחתת משמעותית. מכיוון שקוטר החור הוא בדרך כלל בסדר גודל של מיקרונים, אם יש סטייה בין נקודת המיקוד של קרן הלייזר למיקום החור, יתרחש עיוות האות. לכן, מיקרוסקופים קונפוקאליים משתמשים בדרך כלל במערכת פוקוס אוטומטי, שמגדילה למעשה את זמן המדידה.
מכיוון שמיקרוסקופ הסריקה הקונפוקאלי בלייזר הוא הדמיה נקודתית, על מנת לקבל תמונה דו מימדית של האובייקט, יש צורך להשתמש בסריקה דו מימדית בכיווני x ו-y. מיקרוסקופים שונים משתמשים בשיטות סריקה שונות:
(1) סריקת אובייקטים. כלומר, העצם עצמו נע לפי חוק מסוים, בעוד אלומת האור נשארת ללא שינוי. יתרונות: נתיב אופטי יציב; חסרונות: נדרשת טבלת סריקה גדולה ולכן מהירות הסריקה מוגבלת מאוד.
(2) מערכת סריקת קרן נוצרת על ידי שימוש בגלונומטר רפלקטיבי. כלומר, על ידי שליטה בגלונומטר הסורק, כתם האור הממוקד מוחזר באופן קבוע לשכבה מסוימת של האובייקט כדי להשלים את הסריקה הדו-ממדית. היתרון שלו הוא שהוא בעל דיוק גבוה והוא משמש לעתים קרובות למדידה ברמת דיוק גבוהה. מהירות הסריקה השתפרה בהשוואה לסריקת אובייקטים, אך היא עדיין לא מהירה.
(3) השתמש באלמנט ההטיה האקוסטו-אופטי לסריקה, והסריקה מתבצעת על ידי שינוי תדר הפלט של גל הקול ולאחר מכן שינוי כיוון השידור של גל האור. היתרון הבולט שלו הוא שמהירות הסריקה מהירה מאוד. מערכת הסריקה שפותחה על ידי ארצות הברית משתמשת במסיט אקוסטו-אופטי ליצירת תמונות וידאו בזמן אמת. זה לוקח רק 1/30 שניות כדי לסרוק תמונה דו מימדית, וזה כמעט משיג פלט בזמן אמת.
(4) סריקת דיסק של Nipkow. תהליך הסריקה הושלם על ידי סיבוב הדיסק Nipkow תוך שמירה על רכיבים אחרים ללא תנועה. ניתן לצלם אותו בבת אחת והמהירות היא מהירה מאוד. עם זאת, מכיוון שקרן ההדמיה היא אור מחוץ לציר, יש לתקן את סטיית העדשה מחוץ לציר, וקצב הניצול של אנרגיית האור נמוך מאוד.
