שיטות להרחבת עומק המוקד של מיקרוסקופים מולטיפוטונים
השילוב של שני-מיקרוסקופ לייזר סריקת פוטון ומחוון סידן הוא תקן הזהב לזיהוי אותות נוירונים in vivo. הנוירונים ברשתות עצביות מופצים במרחב תלת-מימדי, וניטור דינמיקת הפעילות שלהם דורשת דרך לשפר במהירות את קצב הדמיית הנפח. עם זאת, שימוש במיקרוסקופ רב-פוטונים סורק סורג כדי לצלם מספר רב של תמונות, אם נעשה שימוש במטרת צמצם מספרי גבוה (NA) להשגת רזולוציה רוחבית גבוהה יותר, זה יביא לעומק מוקד קטן יותר. על מנת לקבל הדמיית נפח בעומק מוקד קטן,
יש צורך לבצע סריקת ציר Z- באמצעים מסוימים, הדמיה של מישורים רבים על ידי סריקת כל מישור מוקד, מה שמגביל מאוד את מהירות ההדמיה. אם ניתן להקריב מידע על תמונה צירית וסריקת נפח ניתן להשיג בסריקה לרוחב אחת על ידי הרחבת עומק הפוקוס, כלומר, מידע הנפח מוקרן על תמונה דו-ממדית אחת, ניתן לשפר מאוד את מהירות ההדמיה. זה נקרא הדמיית עומק מורחב (EDF), שהוא שימושי במיוחד להדמיית מבני אוכלוסיה דלילים הדורשים רזולוציה טמפורלית גבוהה, כגון הדמיה פונקציונלית של פעילות עצבית.
הרזולוציות הציריות והצדדיות של מיקרוסקופ נקבעות על ידי הצמצם המספרי (NA) של עדשת המטרה. NA גבוה יכול למקסם את הרזולוציה הצירית והצדדית, כמו גם את כמות האור שנאסף; NA נמוך יותר יגרום לרזולוציה צירית נמוכה יותר, כלומר לעומק מיקוד ארוך יותר, אך בו-זמנית להקריב רזולוציה צידית ויעילות איסוף האור. שיטת הרחבת עומק המיקוד שתוצג בהמשך יכולה להשיג זאת תוך שמירה על רזולוציה צידית גבוהה ושטף אור מספק.
השימוש במאפנני אור מרחביים ליצירת קרני Bessel דקיקים מוקדים יכול להשיג הדמיית EDF, אך מאפני אור מרחביים הם מגושמים וקשים להתאמה עם חללי מיקרוסקופ צרים; לעומת זאת, מודולי Bessel המבוססים על פירמידות ציריות הם זולים וקומפקטיים, אך הם יכולים ליצור רק נקודות מוקד בעומק קבוע ואינם מתאימים לניסויים שונים הדורשים שינויים מתמשכים בעומק המוקד. כדי לטפל בבעיה זו, בשנת 2018, RONGWEN LU et al. הדגימה מודול Bessel המבוסס על אקסיקון, שבו יש לתרגם רק עדשה אחת לאורך הציר האופטי כדי להתאים באופן רציף את האורך הצירי של נקודת המוקד של Bessel.
איור 1 (א) דיאגרמת מכשיר מודול Bessel; (ב) פונקציית פיזור הנקודה נמדדה בניסוי כאשר D היה -12 מ"מ, 0 מ"מ ו-12 מ"מ, בהתאמה; (ג) הקשר בין רוחב מלא לרוחב בחצי מקסימום, (ד) רוחב צירי מלא בחצי מקסימום, (ה) אות שיא, ו- (ו) כוח אופטי מאחורי עדשת האובייקטיב עם תזוזה L2 D
התקן המודול ליצירת נקודת מוקד Bessel באורך משתנה מוצג באיור 1a. הקרן הגאוסית המתרחשת מעוצבת לקרן מעגלית לאחר שעברה דרך ציר ועדשה L1. מסכת הצמצם העגול שלאחר מכן יכולה לחסום אור תועה הנגרם על ידי פגמים באקסיקון, ובכך לעצב את ההתפלגות הצירית של פונקציית התפשטות נקודות עירור הפוטונים של שני-. לאחר מכן, אלומת האור מוקרנת על הגלוונומטר על ידי עדשות L2 ו-L3, ולאחר מכן מגיעה למישור המוקד האחורי של עדשת המטרה דרך עדשות L4 ו-L5.
עיצובים אלה דומים למודולים מסורתיים מבוססי פירמידה, כשההבדל הוא שעל ידי הזזת L2 או L3 לאורך הציר האופטי, ניתן להתאים באופן רציף את האורך הצירי של מיקוד Bessel. איור 1b מציג את פונקציות פיזור הנקודה הצירית עבור ערכי D של -12 מ"מ, 0 מ"מ ו-12 מ"מ, עם רוחב צירי מלא בחצי מקסימום של 39? מ', 24? M ו-14? מ. כפי שמוצג באיור 1c-f, הזזת העדשה L2 משמאל לימין יכולה לשנות ברציפות את מלוא הרוחב בחצי המקסימום הן בכיוון הרוחבי והן בכיוון הצירי, מה שאומר שניתן לשנות את עומק המיקוד ברציפות. תוצאות הסימולציה המספריות המבוססות על תיאוריית עקיפות וקטור מתאימות היטב לנתוני הניסוי. איור 2 מאמת את השפעת התיקון של גדלים שונים של מסכות טבעות על פגמים באקסיקון. נמצא כי מסכות טבעתיות דקות יותר יכולות לייעל טוב יותר את חלוקת העוצמה הצירית של קרן Bessel הפלט, אך במקביל, הן גם מובילות לאובדן כוח רב יותר.
