מיקרוסקופיה קונפוקלית בלייזר - תכונות ויישומים
מיקרוסקופיה קונפוקל סריקת לייזר (LSCM) היא סוג של מיקרוסקופ שתוכנן על בסיס טכנולוגיית פוקוס מצומד, כלומר מקור אור הלייזר, הדגימה שיש למדוד והגלאי נמצאים כולם במיקומים מצומדים זה עם זה.
בסיסי
במיקרוסקופ כללי, מישור התמונה של התצפית מבודד מהמישור הצירי הסמוך על ידי חופף מישור המוקד של עדשת האובייקטיב עם הגלאי, בעוד שבמיקרוסקופ קונפוקאלי, נקודת אור מוגבלת עקיפה משמשת להארת המדגם ו-A חריר משמש בנתיב האור שנאסף במוקד המצומד של נקודת האור כדי לסנן אור תועה כדי ליצור אפקט בידוד זה ובכך לשפר את הרזולוציה.
תכונות הדמיה
הדמיה בסריקת מקטע אופטי
תכונה נוספת של מיקרוסקופיה קונפוקלית סריקת לייזר היא שמדובר בטכנולוגיית הדמיה סורקת. הטכנולוגיה המסורתית של תאורה רחבת שדה מאירה את הדגימה כולה, כך שניתן ללכוד את התמונה ישירות בעין בלתי מזוינת או בגלאי, אך LSCM משתמש בקרן או בקרני מרובות ממוקדות עוברות דרך הדגימה כדי לסרוק ולתמונה. התמונה המתקבלת נקראת קטע אופטי. להלן מראה את ההבדל בין שיטת ההארה המסורתית בשדה רחב לבין שיטת ההארה הקונפוקלית בסריקת לייזר.
לכן, שיטת עבודה בפועל של מיקרוסקופ קונפוקאלי מודרני היא כפי שמוצג באיור למטה. אור העירור הנפלט מהלייזר עובר דרך מראה דיכרואית ונסרק בכיוון x ו-y של המדגם דרך זוג גלוונומטרים. העירור (או ההשתקפות) של הדגימה היא שאור נכנס לגלאי ה-PMT דרך החריר ונרשם, והתמונה הסרוקה המוקלטת משוחזרת על ידי מחשב כדי לשחזר את תמונת הדגימה בפועל.
צור תמונות "מחסנית z" במישורי מוקד שונים
רק האור המוחזר בחזרה משכבת המדגם המצומדת יכול לעבור דרך החור הקטן בנתיב האור האיסוף, והשתקפויות של שכבת המדגם הלא רלוונטיות הנותרות נחסמות על ידי החור הקטן. זה יכול לגרום לשיפורים משמעותיים ברזולוציה. השוואה זו לצד זו של מיקרוסקופיה פלואורסצנטית רב מימדית ומיקרוסקופיה קונפוקלית של אותה דגימה עבה. כאשר צולמות סדרה של תמונות במישורי מוקד שונים, ניתן ליצור תמונות המכונה בדרך כלל "ערימות z", הממחישות את רווחי הרזולוציה והניגודיות שמציעה מיקרוסקופיה קונפוקלית ואת הסיבות הבסיסיות לרווחים אלו. ניתן לראות כי בחינת התמונה בחלק העליון של הערימה עם מישור ההדמיה מעל הרקמה מגלה כמות גדולה של אור מפוזר בתמונת הקרינה, בעוד שתמונת המיקרוסקופיה הקונפוקלית נראית שחורה. הפחתה זו ב-PSF הצירית גורמת ישירות להפרש הרזולוציה הנצפה בממשק האופטי באמצע ערימת ה-z.
הרזולוציה משופרת מאוד בהשוואה לתאורה רחבה
במיקרוסקופ פלואורסצנטי, עוצמת האור הנפלטת מנקודה אחת מתוארת על ידי פונקציית התפשטות הנקודה (PSF), והתבנית שלה היא דיסק אוורירי. ניתן לתאר את הרזולוציה של מערכת הקרינה על ידי הרדיוס של הדיסק האווירי, אותו ניתן לתאר על ידי הצמצם המספרי של עדשת האובייקט ואורך הגל של אור העירור קובעים.
