מבוא למיקרוסקופיה פלואורסצנטית
מיקרוסקופ פלואורסצנטי הוא להקרין את האובייקט המוכתם בפלואורססאין באור באורך גל קצר, כך שהוא מתרגש לייצר פלואורסצנטי באורך גל ארוך, ולאחר מכן נצפה. במיקרוסקופ פלואורסצנטי, יש לבחור את אור העירור של אורך גל מסוים מאור ההארה של הדגימה כדי ליצור פלואורסצנטי, ולאחר מכן יש להפריד את הקרינה מהאור המעורב של אור העירור והקרינה לצורך התבוננות. לכן, למערכת הסינון יש תפקיד חשוב ביותר בבחירת אורך גל מסוים. מיקרוסקופי פלואורסצנטי נמצאים בשימוש נרחב בביולוגיה, רפואה ותחומים אחרים.
1. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ הקרינה:
(א) מקור אור: מקור האור מקרין אור באורכי גל שונים (מאולטרה סגול ועד אינפרא אדום). ה
(ב) מקור אור מסנן עירור: דרך אור באורך גל מסוים שיכול לגרום לדגימה לייצר פלואורסצנטיות, תוך חסימת אור שאין בו תועלת לקרינה מרגשת. ה
(ג) דגימות פלואורסצנטיות: מוכתמות בדרך כלל בפיגמנטים ניאון. ה
(ד) מסנן חסימה: לחסום את אור העירור שאינו נספג בדגימה ולהעביר באופן סלקטיבי את הקרינה, וכמה אורכי גל מועברים באופן סלקטיבי בפלורסנטיות.
ה
2. סיווג מיקרוסקופי פלואורסצנטי:
מיקרוסקופי פלואורסצנטי מחולקים בדרך כלל לשני סוגים: שידור ופליטת אפי:
א. סוג שידור: אור העירור מגיע מתחתית האובייקט המיועד לבדיקה, והמעבה הוא מעבה שדה כהה, כך שאור העירור לא נכנס לעדשת האובייקט, אלא הקרינה נכנסת לעדשת האובייקט. הוא בהיר בהגדלות נמוכות, אך כהה בהגדלות גבוהות. קשה לפעול בטבילת שמן ובריכוז. קשה במיוחד לקבוע את טווח התאורה בהגדלות נמוכות, אבל זה יכול לקבל רקע שדה ראייה כהה מאוד. סוג השידור אינו משמש עבור עצמים לא שקופים. ה
ב. סוג אפי: סוג ההילוכים כמעט בוטל כיום. רוב מיקרוסקופי הקרינה החדשים הם מסוג אפי. מקור האור מגיע מלמעלה מהאובייקט המיועד לבדיקה, ובנתיב האופטי קיים מפצל אלומה, כך שהוא מתאים לבדיקה גם לחפצים שקופים וגם אטומים. מכיוון שעדשת האובייקטיבית פועלת כעדשת מעבה, היא לא רק קלה לתפעול, אלא גם יכולה להשיג הארה אחידה של כל שדה הראייה מהגדלה נמוכה ועד להגדלה גבוהה. ה
ה
3. אמצעי זהירות עבור פלואורוסקופיה
א. הקרנה ארוכת טווח של אור עירור תגרום להפחתת הקרינה ולכיבוי, לכן קצרו את זמן התצפית ככל האפשר, והשתמשו בבלבול כדי לכסות את אור העירור כאשר לא צופים באופן זמני. ה
ב. בעת התבוננות עם עדשת טבילה בשמן, השתמש ב"שמן שאינו ניאון". ה
ג. הקרינה כמעט תמיד חלשה ויש לבצע אותה בחדר חשוך. ה
ד. עדיף להתקין מייצב מתח באספקת החשמל, אחרת המתח הלא יציב לא רק יפחית את חיי מנורת הכספית, אלא גם ישפיע על השפעת בדיקת המיקרוסקופ. ה
ה
4. שימוש במיקרוסקופיה פלואורסצנטית
1. דרישות הכנה לדגימות מיקרוסקופ פלואורסצנטי
א. מגלשת זכוכית
עובי שקף הזכוכית צריך להיות בין 0.8 ל-1.2 מ"מ. שקופית עבה מדי תספוג יותר אור מצד אחד, ומצד שני לא ניתן לרכז את אור העירור בדגימה. השקופיות חייבות להיות חלקות, בעובי אחיד וללא אוטופלואורסצנטי ברור. לפעמים נעשה שימוש בשקופיות זכוכית קוורץ. ה
ב. זכוכית מכסה
עובי זכוכית הכיסוי הוא כ-0.17 מ"מ, חלק. על מנת לחזק את אור העירור, ניתן להשתמש גם בזכוכית כיסוי יבשה, שהיא זכוכית כיסוי מיוחדת המצופה במספר שכבות של חומרים (כגון מגנזיום פלואוריד) בעלי השפעות הפרעות שונות על אור באורכי גל שונים, מה שיכול להפוך את הקרינה עוברת בצורה חלקה. אור עירור מועבר דרכו, ואור העירור המוחזר מרגש את הדגימה. ה
ג. דוּגמָה
פרוסות רקמה או דגימות אחרות לא צריכות להיות עבות מדי. אם הוא עבה מדי, רוב אור העירור יתכלה בחלק התחתון של הדגימה, בעוד שהחלק העליון הנצפה ישירות על ידי עדשת האובייקט אינו יכול להתרגש במלואו. בנוסף, חפיפת תאים או זיהומים מכסים, ומשפיעים על השיפוט. ה
ד. סוכן הרכבה
גליצרין משמש בדרך כלל כחומר הרכבה, שאסור לו להיות בעל פלואורסצנטי אוטומטי, חסר צבע ושקוף, והבהירות של הקרינה בהירה יותר ב-pH 8.5-9.5, ולא קל לדהות במהירות. לכן, תערובת שווה של גליצרול ו-0.5mol/L פחמן חיץ תמיסת עם pH של 9.0 עד 9.5 משמשת בדרך כלל כחומר הרכבה. ה
ה. שמן מראה
בדרך כלל, יש להשתמש בשמן טבילה בעת התבוננות בדגימות עם מיקרוסקופי פלואורסצנטי בשדה כהה ומטרות טבילה בשמן. עדיף להשתמש בשמן מראה מיוחד שאינו פלואורסצנטי, אותו ניתן להחליף גם בגליצרין הנ"ל, וניתן להשתמש גם בפרפין נוזלי, אך מקדם השבירה נמוך, מה שמשפיע מעט על איכות התמונה.
