איך לבחור בין מיקרוסקופ הפוך למיקרוסקופ פלואורסצנטי?
מיקרוסקופ הוא מכשיר חשוב בתרבית תאים ובניסויים נגזרות קשורים. כיום קיימים סוגים שונים של מיקרוסקופים בשוק, ובחירת מיקרוסקופ העונה על הצרכים ומתאים מהווה אתגר. להלן, נציג את העקרונות של מיקרוסקופים הפוכים ומיקרוסקופים פלואורסצנטיים לבחירה של כל אחד.
המיקרוסקופ ההפוך, כמו מיקרוסקופ רגיל, מורכב בעיקר משלושה חלקים: חלק מכני, חלק תאורה וחלק אופטי. הרכבו של מיקרוסקופ הפוך זהה לזה של מיקרוסקופ זקוף רגיל, אלא שעדשת האובייקטיב ומערכת התאורה הפוכים, כשהראשון מתחת לבמה והשני מעל הבמה. מבנה זה מרחיב באופן משמעותי את המרחק האפקטיבי בין מערכת זרקורי התאורה לבמה, ומקל על הצבת כלי תצפית עבים יותר כגון צלחות תרבית ובקבוקי תרבית תאים (כמובן, ניתן להשתמש גם בשקופיות זכוכית), תוך כדי מרחק העבודה בין עדשת אובייקטיבית והחומר לא צריך להיות גדול מאוד. מיקרוסקופ הפוך משמש מוסדות רפואיים ובריאותיים, אוניברסיטאות ומכוני מחקר לצפייה במיקרואורגניזמים, תאים, חיידקים, תרביות רקמה, תרחיפים, משקעים וכו'. הוא יכול לצפות באופן רציף בתהליך של התפשטות וחלוקה של תאים וחיידקים במצע התרבות, וכן יכול ללכוד כל צורה של תהליך זה. בשימוש נרחב בתחומים כמו ציטולוגיה, טפילולוגיה, אונקולוגיה, אימונולוגיה, הנדסה גנטית, מיקרוביולוגיה תעשייתית ובוטניקה.
מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש לחקר הספיגה, ההובלה, ההפצה והלוקליזציה של חומרים בתוך תאים. עבור האובייקט שנבדק, ישנן שתי דרכים ליצור פלואורסצנטי: פלואורסצנטי ספונטני, הנפלט ישירות מקרינה אולטרה סגולה; הקרינה המשנית מתרחשת כאשר האובייקט הנצפה מטופל בצבעי פלואורסצנטי ונחשף לאור אולטרה סגול לפני פליטת הקרינה. חלק מהחומרים בתאים, כמו כלורופיל, מייצרים פלואורסצנטי ספונטני לאחר שנחשפו לקרינה אולטרה סגולה; חלק מהחומרים עצמם עשויים שלא לפלוט פלואורסצנטי, אבל אם הם מוכתמים בצבעים ניאון או נוגדנים פלואורסצנטיים, הם יכולים גם לפלוט פלואורסצנטיות משנית תחת קרינה אולטרה סגולה. מיקרוסקופ פלואורסצנטי משתמש במקור אור נקודתי עם יעילות זוהרת כדי לפלוט אורך גל מסוים של אור (UV 365nm או UV כחול 420nm) באמצעות מערכת סינון צבע כאור עירור, המעורר את החומרים הפלורסנטיים בדגימה כדי לפלוט צבעים שונים של פלואורסצנטיות. לאחר מכן, הוא נצפה באמצעות הגדלה של עדשת המטרה והעינית. בדרך זו, אפילו עם הקרינה חלשה, ניתן לזהות אותו בקלות ורגישה מאוד תחת רקע מנוגד חזק. הוא משמש בעיקר לחקר מבנה התא, תפקוד והרכב כימי.
ניתן לחלק מיקרוסקופ פלואורסצנטי לשני סוגים: סוג שידור וסוג נופל. הראשון פרימיטיבי יותר, ואילו השני מתקדם יותר. המבנה הבסיסי של שני סוגי מיקרוסקופי הקרינה דומה, כשההבדל העיקרי הוא שאור העירור המועבר עובר דרך הדגימה, ומייצר פלואורסצנציה כולה. לאחר מכן הקרינה נכנסת לעדשת האובייקטיבית, וככל שההגדלה גבוהה יותר, הקרינה חלשה יותר; אור העירור הנופל מקרין על פני הדגימה, ומייצר פלואורסצנטיות החודרת לעדשת המטרה. ככל שההגדלה גבוהה יותר, כך הקרינה חזקה יותר, מה שהופך אותה למתאים לתצפית בעוצמה גבוהה. המרכיבים העיקריים של מיקרוסקופ פלואורסצנטי כוללים מקור אור של מנורת כספית, לוחית מסנן עירור, ספקטרופוטומטר (סוג טיפה), לוחית מסנן דיכוי וקבל שדה כהה (סוג שידור). בנוסף, בשל החימום החמור של מנורות כספית, רובן מצוידות גם במסננים סופגי חום. לכמה מיקרוסקופים פלואורסצנטיים יש גם מטרת ניגודיות פאזה וצמצם עגול, המאפשרים תצפית בניגוד פאזה. חלק ממיקרוסקופי פלואורסצנטי מאמצים מבנה הפוך, שהוא גם מיקרוסקופ הפוך, וכן הלאה.
בנוסף, ניתן להרכיב את המיקרוסקופים הנ"ל למיקרוסקופים דיגיטליים על ידי התקנת CCD, אשר ממירה את התמונות הפיזיות הנראות במיקרוסקופ לתמונות אנלוגיות דיגיטליות ומצלמת אותן במחשב. כתוצאה מכך, אנו יכולים להעביר את המחקר שלנו בתחום המיקרו מתצפית משקפת מסורתית לשעתוק באמצעות תצוגות, ובכך לשפר את יעילות העבודה.
