ספירה ישירה עם מיקרוסקופ לחיידקים
עקרון ניסוי
ספירה ישירה תחת מיקרוסקופ באמצעות המוציטומטר היא שיטת ספירה מיקרוביאלית נפוצה. היתרון בשיטה זו הוא שהיא אינטואיטיבית ומהירה. מניחים את תרחיף החיידקים המדולל כראוי (או ההשעיה של נבגים) בתא הספירה בין השקופית לזכוכית הכיסוי של ההמוציטומטר, וספור מתחת למיקרוסקופ. מכיוון שנפח תא הספירה קבוע (0.1mm2), ניתן להמיר אותו למספר הכולל של מיקרואורגניזמים ליחידת נפח בהתאם למספר המיקרואורגניזמים שנצפו תחת המיקרוסקופ. מכיוון ששיטה זו סופרת את סכום החיידקים החיים והמתים, היא נקראת גם שיטת ספירת החיידקים הכוללת.
המוציטומטר הוא בדרך כלל מגלשת זכוכית מיוחדת שעליה ארבעה חריצים יוצרים שלוש פלטפורמות. הפלטפורמה באמצע מחולקת לשני חצאים על ידי חריץ אופקי קצר. רשת חקוקה על הרציף מכל צד. כל רשת מחולקת לתשעה ריבועים גדולים. הריבוע הגדול באמצע הוא חדר הספירה. מיקרואורגניזמים נספרים בתא הספירה. המבנה של לוח ספירת תאי הדם מוצג באיור Ⅷ-1.
לקנה המידה של חדר הספירה יש בדרך כלל שני מפרטים, האחד הוא שריבוע גדול מחולק ל-16 ריבועים אמצעיים, וכל ריבוע אמצעי מחולק ל-25 ריבועים קטנים (איור Ⅷ-2); השני הוא ריבוע גדול הריבוע מחולק ל-25 ריבועים אמצעיים, וכל ריבוע אמצעי מחולק ל-16 ריבועים קטנים (איור Ⅷ-1, C). אבל לא משנה באיזה סוג לוח ספירה מדובר, מספר הריבועים הקטנים בכל ריבוע גדול זהה, כלומר 16×25=400 ריבועים קטנים, כפי שמוצג באיור Ⅷ-2.
אורך הצלע של כל ריבוע גדול הוא 1 מ"מ, ושטחו של כל ריבוע גדול הוא 1 מ"מ. לאחר כיסוי זכוכית הכיסוי, הגובה בין זכוכית השקופית לזכוכית הכיסוי הוא 0.1 מ"מ, כך שנפח תא הספירה הוא 0.1 מ"מ3.
בעת ספירה, סופרים בדרך כלל את המספר הכולל של החיידקים בחמשת הריבועים האמצעיים, לאחר מכן משיגים את הערך הממוצע של כל ריבוע אמצעי, ולאחר מכן מכפילים ב-16 או 25 כדי לקבל את המספר הכולל של חיידקים בריבוע גדול, ולאחר מכן מומר ל- המספר הכולל של חיידקים בתמיסת חיידקים של 1 מ"ל.
ציוד מעבדה
המוציטומטר, מיקרוסקופ, כיסוי, נימי סטרילי;
חומרים ניסיוניים
השעיה Saccharomyces cerevisiae
הליך ניסיוני (שיטת ספירה ישירה במיקרוסקופ)
1. דילול
יש לדלל כראוי את ההשעיה Saccharomyces cerevisiae. אם התמיסה החיידקית אינה סמיכה, אין צורך לדלל אותה.
2. חדר ספירה מיקרוסקופי
לפני הוספת דגימות, בצע בדיקה מיקרוסקופית של תא הספירה של לוח הספירה. אם יש לכלוך, יש לנקות אותו לפני הספירה.
3. הוסף מדגם
כסו את צלחת ההמוציטומטר הנקייה והיבשה בכוס כיסוי, ולאחר מכן השתמשו בטפטפת דקיקה סטרילית כדי להפיל טיפה קטנה של תמיסת Saccharomyces cerevisiae המדוללת מקצה זכוכית הכיסוי (לא יותר מדי), כך שתמיסת החיידקים. קרוב לפער לאורך הפער. אוסמוזה נימית נכנסת לתא הספירה בעצמה, וניתן למלא את תא הספירה הכללי בנוזל חיידקי. שימו לב שלא יהיו בועות אוויר.
4. ספירת מיקרוסקופים
לאחר מנוחה של 5 דקות, הנח את ההמוציטומטר על במת המיקרוסקופ, השתמש תחילה בעדשה בעלת עוצמה נמוכה כדי למצוא את מיקום תא הספירה, ולאחר מכן עבור לעדשה בעלת עוצמה גבוהה לספירה. אם נמצא שהתמיסה החיידקית סמיכה מדי או דקה מדי לפני הספירה, יש צורך להתאים מחדש את הדילול לפני הספירה. בדרך כלל, דילול הדגימה דורש בערך 5-10 חיידקים בכל תא. כל תא ספירה בוחר את החיידקים ב-5 רשתות אמצעיות (אופציונלי 4 פינות ורשתות מרכזיות) לספירה. החיידקים על קו הרשת נספרים בדרך כלל רק על הקווים העליונים והימניים. במקרה של ניצני שמרים, כאשר גודל גוף הניצן מגיע למחצית מתא האם, סופרים שני חיידקים. ספור דגימה כדי לחשב את תכולת החיידקים של הדגימה מתוך הערכים שנספרו בשני תאי הספירה.
5. ניקוי ההמוציטמטר
לאחר השימוש יש לשטוף את לוחית ספירת תאי הדם על הברז בסילוני מים, לא לשטוף אותה עם חפצים קשים ולייבש אותה לבד או במייבש שיער לאחר הכביסה. בדיקה מיקרוסקופית, התבוננו האם יש שאריות של חיידקים או משקעים אחרים בכל תא. אם הוא לא נקי, יש לשטוף אותו שוב ושוב עד שהוא נקי.
