השוואה בין מיקרוסקופ קונפוקאלי למיקרוסקופ אופטי רגיל
מיקרוסקופ אופטי כללי
המיקרוסקופ הביולוגי הכללי מורכב משלושה חלקים, כלומר: ① מערכת תאורה, כולל מקור אור וקבל; ② מערכת הגברה אופטית, המורכבת מעדשת אובייקטיבית ועינית, היא הגוף העיקרי של המיקרוסקופ. על מנת לחסל סטייה כדורית ואברציה כרומטית, הן העינית והן עדשת האובייקטיבית מורכבות מקבוצות עדשות מורכבות; (3) מכשיר מכני, המשמש לקיבוע חומרים ותצפית נוחה.
אם תמונת המיקרוסקופ ברורה או לא תלויה לא רק בהגדלה, אלא גם ברזולוציה של המיקרוסקופ. רזולוציה מתייחסת ליכולת של המיקרוסקופ (או המקום בו עיני האדם נמצאות במרחק של 25 ס"מ מהמטרה) להבחין במרווח הקטן של האובייקט צוי. הרזולוציה תלויה באורך הגל של האור, ביחס הצמצם ובאינדקס השבירה של המדיום, המתבטא בנוסחה:
R=0.61λ /N．A. N．A．＝ｎsin /2
איפה: n= מקדם השבירה של מדיום;=זווית מראה (זווית הפתיחה של הדגימה לצמצם העדשה), וצמצם מספרי NA=. זווית המראה תמיד פחות מ-180? לכן, ערך zui של sina/2 חייב להיות קטן מ-1.
מקדם השבירה של הזכוכית המשמשת לייצור עדשות אופטיות הוא 1.65~1.78, ומקדם השבירה של המדיום המשמש קרוב יותר לזה של הזכוכית, ככל שיותר טוב. עבור עדשת האובייקטיב היבשה, המדיום הוא אוויר, ויחס הצמצם הוא בדרך כלל 0.05 ~ 0.95; עדשת השמן משתמשת באספלט ריחני כאמצעי, וקצב פתיחת העדשה יכול להיות קרוב ל-1.5.
אורך הגל של אור רגיל הוא 400~700nm, כך שהרזולוציה של המיקרוסקופ אינה פחותה מ-0.2μm, והרזולוציה של העין האנושית היא 0.2mm, כך שההגדלה הגדולה של Zui תוכננה על ידי המיקרוסקופ הכללי הוא בדרך כלל 1000X x.
למה אתה צריך מיקרוסקופ קונפוקאלי?
1. המיקרוסקופ האופטי השתכלל באמצעות המאמצים והשיפור של קודמינו הגדולים. למעשה, מיקרוסקופים רגילים יכולים לספק לנו תמונות מיקרוסקופיות יפות בפשטות ובמהירות. עם זאת, קרה אירוע שהביא חדשנות מהפכנית לעולם המיקרוסקופ הכמעט מושלם הזה, שהוא המצאת "מיקרוסקופ קונפוקאלי סריקת לייזר". מיקרוסקופ חדש זה מאופיין באימוץ מערכת אופטית השואבת רק את מידע התמונה במישור שבו מרוכז הפוקוס, ושיחזור המידע המתקבל בזיכרון התמונה תוך שינוי הפוקוס, כך שתהיה תמונה חיה עם מידע תלת מימדי מלא. ניתן לרוכשו. בשיטה זו ניתן להשיג מידע על צורת פני השטח שלא ניתן לאשר באמצעות מיקרוסקופים רגילים. בנוסף, עבור מיקרוסקופים אופטיים רגילים, "שיפור הרזולוציה" ו"העמקת עומק המיקוד" הם תנאים סותרים, במיוחד בהגדלה גבוהה, אך עבור מיקרוסקופים קונפוקאליים, הבעיה הזו נפתרת.
2. יתרונות של מערכת אופטית קונפוקלית
מערכת אופטית קונפוקלית מאירה את נקודת הדגימה, והאור המוחזר נקלט גם על ידי קולטנים נקודתיים. כאשר הדגימה ממוקמת בעמדת הפוקוס, כמעט כל האור המוחזר יכול להגיע לפוטו-רצפטור, אך כאשר הדגימה סוטה מהפוקוס, האור המוחזר אינו יכול להגיע לפוטו-רצפטור. כלומר, במערכת האופטית הקונפוקלית, רק התמונה החופפת לפוקוס תוצא, והפקולה והאור המפוזר חסר התועלת יהיו מסוככים.
3. למה להשתמש בלייזר?
במערכת האופטית הקונפוקלית, המדגם מואר והאור המוחזר נקלט גם על ידי קולטן נקודתי. לכן, מקור אור נקודתי הופך להיות הכרחי. הלייזר שייך למקור אור מאוד נקודתי. ברוב המקרים, מקור האור של המיקרוסקופ הקונפוקאלי מאמץ מקור אור לייזר. בנוסף, המאפיינים של הלייזר, כמו מונוכרומטיות, כיווניות וצורת קרן מצוינת, הם גם סיבות חשובות לשימוש הרחב שלו.
4. מתאפשרת תצפית בזמן אמת המבוססת על סריקה במהירות גבוהה.
בסריקת הלייזר, נעשה שימוש במסיט האופטי האקוסטי (AO prime element) בכיוון האופקי ו- Servo Galvano-mirror משמש בכיוון האנכי. מכיוון שאין חלק רטט מכני ביחידת ההטיה האופטית האקוסטית, היא יכולה לסרוק במהירות גבוהה, וניתן לצפות בזמן אמת על מסך הניטור. המהירות הגבוהה של מצלמה זו היא פרויקט חשוב מאוד שמשפיע ישירות על מהירות המיקוד ושליפת המיקום.
5. קשר בין מיקום הפוקוס והבהירות
במערכת האופטית הקונפוקלית, כאשר הדוגמה ממוקמת נכון במיקום הפוקוס, הבהירות גדולה, ולפניה ואחריה הבהירות שלה תרד בחדות (קו מוצק באיור 4). הסלקטיביות הרגישה הזו של מישור המוקד היא גם העיקרון של מדידת כיוון הגובה של המיקרוסקופ הקונפוקאלי והרחבת עומק המוקד. לעומת זאת, למיקרוסקופ האופטי הרגיל אין שינוי ברור בבהירות לפני ואחרי מיקום המיקוד (קו מקווקו באיור 4).
6. ניגודיות גבוהה ורזולוציה גבוהה
במיקרוסקופ אופטי כללי, האור המוחזר החורג מהפוקוס יפריע, והוא יחפוף לחלק הדמיית הפוקוס, ובכך יקטין את ניגודיות התמונה. לעומת זאת, במערכת האופטית הקונפוקלית, האור המפוזר מחוץ למוקד והאור המפוזר בתוך עדשת האובייקט מוסרים כמעט לחלוטין, כך שניתן לקבל תמונה בעלת ניגודיות גבוהה מאוד. בנוסף, מכיוון שהאור עובר דרך עדשת האובייקטיב פעמיים, התמונה הנקודתית מתחדדת תחילה, וגם הרזולוציה של המיקרוסקופ משתפרת.
7. פונקציית לוקליזציה אופטית
במערכת האופטית הקונפוקלית, האור המוחזר של החלק שאינו נקודת המוקד מוגן על ידי מיקרו-נקבים. לכן, כאשר מתבוננים במדגם תלת מימדי, נוצרת תמונה כמו זו שנוצרה לאחר חיתוך המדגם עם המוקד (איור 5). אפקט זה נקרא לוקליזציה אופטית, השייך לאחת מההתמחויות של מערכת אופטית קונפוקלית.
8. מיקוד פונקציית זיכרון נע
מה שנקרא האור המוחזר מחוץ למוקד מוגן על ידי המיקרו-נקבים. מצד שני, ניתן לשקול שכל הנקודות בתמונה שנוצרות על ידי המערכת האופטית הקונפוקלית חופפות למוקד. לכן, אם הדגימה התלת מימדית מועברת לאורך כיוון ציר Z (ציר אופטי), התמונה תצטבר ותאוחסן בזיכרון, ובסופו של דבר zui יקבל את התמונה שנוצרה על ידי צירוף מקרים של כל המדגם והפוקוס . בדרך זו, הפונקציה של עומק מיקוד אינסופי נקראת פונקציית זיכרון נייד.
9. פונקציית מדידת צורת פני השטח
בפונקציית העברת הפוקוס, ניתן למדוד את צורת פני השטח של המדגם בצורה ללא מגע על ידי הוספת לולאת רישום גובה. בהתבסס על פונקציה זו, ניתן לרשום את הקואורדינטות של ציר ה-Z הנוצרות מערך הבהירות הגדול של zui בכל פיקסל, ועל סמך מידע זה ניתן לקבל את המידע הקשור לצורת פני השטח של המדגם.
10. פונקציית מדידת מיקרו-גודל ברמת דיוק גבוהה
יחידת קליטת האור מאמצת חיישן הדמיה CCD חד-ממדי, כך שלא ניתן יהיה להשפיע על הטיית הסריקה של מכשיר הסריקה, כך שניתן להשלים מדידה ברמת דיוק גבוהה. בנוסף, מכיוון שפונקציית הזיכרון הזזת פוקוס עם עומק פוקוס מתכוונן מאומצת בו-זמנית, ניתן לבטל את שגיאת המדידה הנגרמת מהיסט המיקוד.
11. ניתוח תמונה תלת מימדית
באמצעות פונקציית מדידת צורת פני השטח, ניתן ליצור בקלות את התמונה התלת מימדית של משטח המדגם. לא רק זה, אלא גם סוגים רבים של ניתוח יכולים להתבצע, כגון: מדידת חספוס פני השטח, שטח, נפח, שטח פנים, מעגליות, רדיוס, אורך צוי, היקף, מרכז כובד, תמונה טומוגרפית, טרנספורמציה FFT, קו מדידת רוחב וכן הלאה.
מיקרוסקופ סריקה קונפוקאלי לייזר יכול לשמש לא רק כדי לצפות במורפולוגיה של התא, אלא גם לניתוח כמותי של רכיבים ביוכימיים בתאים, סטטיסטיקות צפיפות אופטית ומדידות מורפולוגיה של התא.
