סקירה של מספר טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה על-על

סקירה של מספר טכניקות מיקרוסקופיה ברזולוציה על-על

עבור מיקרוסקופ אור קונבנציונלי, עקיפה של אור מגבילה את רזולוציית ההדמיה לכ-250 ננומטר. כיום, טכניקות רזולוציית-על יכולות לשפר זאת ביותר מפקטור 10. טכניקה זו מושגת בעיקר באמצעות שלוש שיטות: מיקרוסקופ לוקליזציה של מולקולה בודדת, לרבות מיקרוסקופיה של לוקליזציה רגישות לאור (PALM) ומיקרוסקופיה סטוכסטית שחזור אופטי (STORM); מיקרוסקופ תאורה מובנית (SIM); ומיקרוסקופ דלדול פליטה מעורר (STED). איך לבחור טכנולוגיית רזולוציית-על זה מה שחשוב לכולם. "למרבה הצער, אין עקרונות פשוטים להחלטה באיזו שיטה להשתמש", אומר מתיו סטרסי, חוקר פוסט-דוקטורט באוניברסיטת אוקספורד, בריטניה. "לכל אחד יש את היתרונות והחסרונות שלו". מדענים כמובן גם מבררים כיצד לבחור את השיטה הנכונה לפרויקט מסוים. "בהקשר של הדמיה ביולוגית, גורמים מרכזיים שיש לקחת בחשבון כוללים: רזולוציה מרחבית וזמנית, רגישות לפוטו-דאג', קיבולת תיוג, עובי דגימה וקרינת רקע או פלואורסצנטיות עצמית של תאים." איך זה עובד המיקרוסקופים השונים ברזולוציית העל פועלים בדרכים שונות. במקרה של PALM ו-STORM, רק חלק קטן של סמנים ניאון נרגשים או מופעלים ברגע נתון, מה שמאפשר לוקליזציה עצמאית שלהם בדיוק רב. ביצוע תהליך זה עם כל התוויות הפלורסנטיות מביא לתמונה שלמה ברזולוציית העל. סטפן הל, אחד הזוכים בפרס נובל לכימיה לשנת 2014 ומנהל מכון מקס פלנק לכימיה ביו-פיזיקלית, אמר: "מערכת ה-PALM/STORM קלה יחסית להתקנה, אבל קשה ליישם אותה, בגלל הפלורסנט. הקבוצה חייבת להיות בעלת יכולת פוטואקטיבציה. מגבלות החיסרון הוא שהם צריכים לזהות מולקולה ניאון בודדת בהקשר של תא, והם פחות אמינים מ-STED." STED משתמשת בדופק לייזר כדי לעורר את הפלואורופור ובלייזר בצורת טבעת כדי לכבות את הפלואורופור, מה שמותיר רק את הפלואורסצנטי הבינוני בגודל ננומטר לרזולוציית על. סריקת הדגימה כולה מייצרת תמונה. "היתרון של STED הוא שמדובר בטכנולוגיית לחצן", הסביר הל. "זה עובד כמו מיקרוסקופ פלואורסצנטי קונפוקאלי סטנדרטי." הוא יכול גם לדמיין תאים חיים באמצעות פלואורפורים כגון חלבונים ניאון ירוקים או צהובים וצבעים שמקורם ברודמין. השוואה פרמטרית למרות שכל טכניקות רזולוציית העל עולות על מיקרוסקופ האור המקובל מבחינת הרזולוציה, הן שונות זו מזו. ה-SIM מכפיל בערך את הרזולוציה לסביבות 100 ננומטר. PALM ו-STORM יכולים לפתור מטרות של 15 ננומטר. לפי Hell, STED מספקת רזולוציה מרחבית של 30 ננומטר בתאים חיים ו-15 ננומטר בתאים קבועים. כשמדובר ביישומים ספציפיים, עלינו לשקול גם את יחס האות לרעש. במקרים מסוימים, רזולוציה נמוכה יותר אך SNR גבוה יותר עשויה לגרום לתמונה טובה יותר מההפך (רזולוציה גבוהה יותר אך SNR נמוך יותר). מהירות רכישת התמונה היא גם חשובה מאוד, במיוחד עבור תאים חיים. "כל טכניקות רזולוציית העל איטיות יותר מטכניקות הדמיית פלואורסצנטיות קונבנציונליות," אמר סטרייסי. "PALM/STORM הוא האיטי ביותר, הוא זקוק לעשרות אלפי פריימים כדי להשיג תמונה בודדת, SIM זקוק לעשרות פריימים, ו-STED היא טכנולוגיית סריקה, כך שמהירות הרכישה תלויה בגודל שדה הראייה". בנוסף לתאים חיים או לתאי הדמיה קבועים, כמה מדענים רוצים גם להבין איך חפצים נעים. סטריי מעוניין להבין את הדינמיקה של מערכות ביולוגיות בתאים חיים, לא רק תמונות סטטיות. הוא משלב PALM עם מעקב אחר חלקיקים בודדים כדי לנתח דינמיקה בתאים חיים. בדרך זו, הוא יכול לעקוב ישירות אחר מולקולות הסמן בזמן שהן מבצעות את תפקידיהן. עם זאת, הוא סבור ש-SIM אינו מתאים לחקר תהליכים דינמיים אלו ברמה המולקולרית, אך בגלל מהירות הרכישה המהירה שלו, הוא מתאים במיוחד לצפייה בדינמיקה של מבנים גדולים יותר, כמו כרומוזומים שלמים. התוצאות האחרונות בשנת 2017, צוות Hell's דיווח על מיקרוסקופ הרזולוציה העל MINFLUX במדע. לפי Hell, שיטת רזולוציית-על זו משיגה לראשונה רזולוציה מרחבית של 1 ננומטר. בנוסף, הוא יכול לעקוב אחר מולקולות בודדות בתאים חיים לפחות פי 100 מהר יותר משיטות אחרות. מדענים אחרים דיברו גם הם על מיקרוסקופ MINFLUX. "יישומים וגישות חדשות מפותחות כל הזמן, אבל שתי התקדמות בולטות בעיני", אמר שכטמן. האחד הוא MINFLUX. "הוא משתמש בגישה גאונית כדי לקבל מיקום מולקולרי מדויק מאוד." לגבי הפיתוח המרגש השני, שכטמן הזכיר את WE Moerner ועמיתיו באוניברסיטת סטנפורד. מורנר היה גם חתן פרס נובל לכימיה לשנת 2014. אחד הזוכים. כדי לטפל במגבלה של רזולוציית הדמיה הנגרמת על ידי פיזור אנזוטרופי של מולקולות בודדות ניאון, המדענים השתמשו בקיטוב עירור שונים כדי לקבוע את הכיוון והמיקום של המולקולות. בנוסף, הם פיתחו משטחי אישונים עדינים. טכניקות אלו משפרות את היכולת לבצע לוקליזציה של מבנים. על תוויות פלורסנט ביישומים רבים ברזולוציית העל, התוויות חשובות מאוד. יש גם כמה חברות המספקות מוצרים נלווים. לדוגמה, Miltenyi הגרמנית התחברה עם Abberior, חברה שהוקמה על ידי Stefan Hell, כדי לספק שירותי צימוד נוגדנים מותאמים אישית עבור צבעי מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר. מספר חברות אחרות מציעות גם מרקרים תואמים. "ה-Nano-Boosters שלנו קטנים מאוד, רק 1.5 kDa, ומאוד ספציפיים", אומר כריסטוף אקרט, קצין שיווק ב-ChromoTek. חלבונים אלו קושרים חלבונים פלורסנטים ירוקים ואדומים (GFP ו-RFP). הם מופקים משברי נוגדני אלפקה, הידועים כ-VHH או ננו-גודיים, בעלי תכונות קשירה מצוינות ואיכות יציבה ללא וריאציה מאצווה לאצווה. טושים אלו מתאימים לטכניקות רזולוציית-על שונות כולל SIM, PALM, STORM ו-STED. איי-הוי טאנג, עוזר פרופסור בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת מרילנד, ועמיתיו השתמשו ב-GFP-Booster ו-STORM של ChromoTek כדי לחקור את התפשטות המידע במערכת העצבים. הם מצאו ננו-צבירים מולקולריים, הנקראים ננו-עמודים, בנוירונים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטים. המדענים מאמינים שמבנה זה מראה שמערכת העצבים המרכזית משתמשת בעקרונות פשוטים כדי לשמור ולווסת את היעילות הסינפטית. גרסאות שונות של הדמיה ברזולוציית על ומספר גדל והולך של שיטות לוקחות את המדענים עמוק יותר לתוך תעלומות ביולוגיות. על ידי שבירת גבול הדיפרקציה של האור הנראה, ביולוגים יכולים אפילו "לפקח מקרוב" על פעולות התאים.